系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細(xì)胞唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)變化及機制探討

涂洋，陳光亮，曹珊，陳曉翔(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海200001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血白細(xì)胞唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)變化及機制探討

涂洋，陳光亮，曹珊，陳曉翔
(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海200001)

摘要:目的觀察系統(tǒng)性紅斑狼瘡( SLE)患者外周血白細(xì)胞唾液酸轉(zhuǎn)移酶( ST8SIA)的表達(dá)變化，并探討其機制。方法選擇SLE患者(觀察組)和健康志愿者(對照組)各24例，采用RT-PCR法檢測外周血白細(xì)胞ST8SIA1 ～6 mRNA;對有統(tǒng)計學(xué)意義的ST8SIA mRNA，采用基因芯片技術(shù)分析血漿中靶向其3'非翻譯區(qū)( 3'UTR)的miRNA。結(jié)果兩組外周血白細(xì)胞均無ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA5 mRNA表達(dá);觀察組ST8SIA1、4、6 mRNA相對表達(dá)量分別為1.524±0.229、13.780±1.669、2.238±0.387，對照組分別為1.129±0.106、1.087±0.089、0.550± 0.054;兩組ST8SIA4、6 mRNA比較，P均＜0.05。靶向調(diào)節(jié)ST8SIA4 mRNA的miRNA表達(dá)下降12條、升高1條，靶向調(diào)節(jié)ST8SIA6 mRNA的miRNA表達(dá)下降、升高各4條。結(jié)論SLE患者外周血白細(xì)胞中ST8SIA4、ST8SIA6 mRNA表達(dá)升高，與對其進(jìn)行靶向調(diào)控的miRNA表達(dá)異常有關(guān)。

關(guān)鍵詞:系統(tǒng)性紅斑狼瘡;α2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶;微小核糖核酸;聚合酶鏈反應(yīng);基因芯片

Expression changes of sialyltransferase in peripheral blood leucocytes of patients with systemic lupus erythematosus and the possible mechanism.

TU Yang，CHEN Guang-liang，CAO Shan，CHEN Xiao-xiang
( Renji Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of sialyltransferase ( ST8SIA) in the peripheral blood leucocytes of patients with systemic lupus erythematosus ( SLE) and to investigate the possible mechanism.Methods ST8SIA1-6 was detected by RT-PCR in the peripheral blood leucocytes in 24 SLE patients and 24 normal donors.We analyzed the miRNAs that targeting 3untranslated region ( UTR) by microarray chip.Results The expression of ST8SIA2，ST8SIA3 and ST8SIA5 was not detected in the peripheral blood leucocytes of the two groups.The relative expression levels of ST8SIA1 mRNA，ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA in the observation group were 1.524± 0.229，13.78±1.669 and 2.238±0.387，and they were 1.129±0.106，1.087±0.089 and 0.550±0.054 in the control group.The difference in ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA of the two groups was statistically different ( all P＜0.05).There were 12 down-regulated plasma miRNAs that regulated the 3UTR of ST8SIA4 mRNA and 1 up-regulated plasma miRNA.There were 4 plasma miRNAs that made the 3UTR of ST8SIA6 mRNA down-regulated and 4 plasma miRNAs up-regulated.Conclusion The expression levels of ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA in patients with SLE are increased，which may be related with the abnormal expression of plasma miRNAs that can regulate the 3UTR of ST8SIA4 mRNA and ST8SIA6 mRNA.

Key words:systemic lupus erythematosus;α2，8-sialyltransferases; miRNA; polymerase chain reaction; microarray

系統(tǒng)性紅斑狼瘡( SLE)是一種原因未明，以多系統(tǒng)或器官病變和血清中出現(xiàn)大量致病性自身抗體為特征的自身免疫性疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者血漿中的IgG-Fc段唾液酸化程度比正常人降低，并且與SLE活動度呈負(fù)相關(guān)［2，3］。唾液酸轉(zhuǎn)移酶( ST8SIA)是一種唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶，共有6種亞型( ST8SIA1～6)。MicroRNAs( miRNAs)是在真核生物體內(nèi)廣泛存在的一類具有調(diào)控功能的小RNA。

成熟的miRNAs通過堿基互補配對方式識別特定mRNA的3'非翻譯區(qū)( 3'UTR)，使其降解或阻遏其翻譯過程，從而調(diào)控基因表達(dá)［4，5］。研究發(fā)現(xiàn)很多疾病與miRNA表達(dá)水平有關(guān)，如心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等［6］。血漿miRNA具有耐RNA酶的特點，在血漿中穩(wěn)定存在［7，8］。2013年1～6月，我們檢測了SLE患者外周血白細(xì)胞ST8SIA表達(dá)變化，并分析血漿中對其進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)的miRNA水平，探討ST8SIA表達(dá)變化的機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集我院同期收治的SLE患者24例(觀察組)，均為女性，年齡18～55歲，均符合2009年SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除重疊有其他結(jié)締組織疾病者，原發(fā)造血系統(tǒng)疾病者，近期有外科手術(shù)、外傷者，腫瘤患者。對照組為24例女性健康志愿者，年齡18～55歲，均無自身免疫性疾病、感染、外傷及其他疾病。兩組年齡、性別比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2方法

1.2.1外周血白細(xì)胞ST8SIA mRNA檢測兩組均于清晨空腹抽取外周肘正中靜脈血5 mL，加紅細(xì)胞裂解液裂紅;采用TRIzol法提取1 μg總RNA，用Takara試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以核糖體蛋白L13 ( RPL13)為內(nèi)參，采用RT-PCR法檢測ST8SIA1～6 mRNA，操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。TRIzol購自Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自Takara公司，引物及內(nèi)參均購自生工生物公司。以2－ΔΔCT表示其相對表達(dá)量。

1.2.2血漿靶向調(diào)節(jié)ST8SIA mRNA的miRNA檢測兩組均于清晨空腹抽取外周肘正中靜脈血5 mL，3 000 r/m離心5 min;取1 mL血漿，采用TRIzol法提取3 μg總miRNA;然后進(jìn)行標(biāo)記、雜交，用Axon GenePix 4000B microarray scanner掃描檢測熒光。從http://www.targetscan.org/中找到靶向1.2.1中有統(tǒng)計學(xué)意義ST8SIA mRNA 3'UTR的miRNA，使用GenePix Pro 6.0軟件對miRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并從基因芯片結(jié)果中逐個尋找其表達(dá)水平變化。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法采用graphpad prism 5統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以珋x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組外周血白細(xì)胞ST8SIA mRNA表達(dá)比較兩組外周血白細(xì)胞均無ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA5 mRNA表達(dá);兩組外周血白細(xì)胞ST8SIA1、4、6 mRNA比較，見表1。

表1　兩組ST8SIA mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1　兩組ST8SIA mRNA表達(dá)水平比較(±s)

注:與對照組相比，*P＜0.05。

組別ST8SIA1 mRNA　 ST8SIA4 mRNA　 ST8SIA6 mRNA觀察組　1.524±0.229　 13.780±1.669*　2.238±0.387*對照組1.129±0.106　 1.087±0.089　 0.550±0.054

2.2血漿靶向調(diào)節(jié)ST8SIA4、ST8SIA 6 mRNA的miRNA表達(dá)變化見表2。

表2　血漿靶向調(diào)節(jié)T8SIA4、ST8SIA 6 mRNA 的miRNA表達(dá)變化

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)很多生理過程中發(fā)揮著重要作用，其可應(yīng)用唾液酸供體單磷酸胞苷活化的唾液酸對不同的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行唾液酸化修飾［9］。唾液酸的高表達(dá)會影響腫瘤細(xì)胞的黏附特性，從而使腫瘤細(xì)胞更易轉(zhuǎn)移［10］。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在外周血白細(xì)胞中ST8SIA1、ST8SIA4、ST8SIA6表達(dá)，而ST8SIA2、ST8SIA3、ST8SIA4不表達(dá)。本研究結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測一致，并發(fā)現(xiàn)在外周血白細(xì)胞中ST8SIA4和ST8SIA6表達(dá)比正常人升高。

ST8SIA4可以催化神經(jīng)細(xì)胞黏附分子形成，在胎兒腦組織中高表達(dá)，在成人腦組織中表達(dá)較低，提示其在大腦發(fā)育中具有重要作用。ST8SIA4在其他胎兒組織中如肝、肺、腎中也表達(dá)，在成人組織如脾臟、胸腺和心臟中適度表達(dá)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，ST8SIA4在腫瘤中表達(dá)異常。ST8SIA4位于5號常染色體長臂上21號染色區(qū)間。有研究者發(fā)現(xiàn)，成人T淋巴細(xì)胞白血病該區(qū)域異常表達(dá)，提示ST8SIA4可能參

與T淋巴細(xì)胞的增殖［12］。ST8SIA6與細(xì)胞之間的交流、相互反應(yīng)、黏附和蛋白質(zhì)定位有關(guān)，影響淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞的相互反應(yīng)和活化，從而對免疫功能產(chǎn)生影響［13，14］。研究發(fā)現(xiàn)，ST8SIA6是T細(xì)胞成熟過程中一種關(guān)鍵的唾液酸轉(zhuǎn)移酶;干擾造血干細(xì)胞中ST8SIA6表達(dá)，發(fā)現(xiàn)盡管能夠產(chǎn)生B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，但是T細(xì)胞發(fā)育完全受阻［15］。由此推測，SLE患者ST8SIA4和ST8SIA6高表達(dá)，使T細(xì)胞增殖活躍，導(dǎo)致免疫紊亂，與SLE發(fā)病機制有關(guān)。盡管SLE患者外周血白細(xì)胞中ST8SIA4和ST8SIA6 mRNA表達(dá)水平升高，但是SLE患者的血漿IgG-Fc段唾液酸化程度較正常人降低，其可能原因是唾液酸轉(zhuǎn)移酶的mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的過程受阻，或者唾液酸轉(zhuǎn)移酶對糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行唾液酸化修飾時發(fā)生功能障礙，其具體機制需要進(jìn)一步研究。

血漿中的miRNA存在于各種載體中，這些包含miRNA的載體猶如“特洛伊木馬”，其中的蛋白成分因具有抗原活性而能夠誘導(dǎo)機體免疫激活;載體可被單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等靶細(xì)胞攝入，然后釋放其中的miRNA;以該種機制逃避機體對其清除，從而達(dá)到調(diào)控靶細(xì)胞分化及免疫功能［16］。通過對基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，血漿中許多靶向ST8SIA4、ST8SIA6 mRNA 3'UTR的miRNA水平均發(fā)生改變，提示起關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNA表達(dá)水平下降，對ST8SIA4 mRNA和ST8SIA6 mRNA的降解和阻遏其翻譯過程的能力減弱，從而導(dǎo)致ST8SIA4 mRNA和ST8SIA6 mRNA表達(dá)水平升高。因此，SLE患者體內(nèi)miRNA表達(dá)異常，可導(dǎo)致體內(nèi)唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)升高，進(jìn)而影響體內(nèi)免疫細(xì)胞反應(yīng)和活化，從而對免疫功能產(chǎn)生影響，參與SLE發(fā)病過程。下一步我們將研究能夠調(diào)控唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的miRNA，進(jìn)而探索miRNA如何通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶途徑參與SLE的發(fā)病。

參考文獻(xiàn):

［1］Bennett L，Karolina PA，Arce E，et al.Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood［J］.J Exp Med，2003，197( 6) : 711-723.

［2］陳玉強，陳曉翔，王元.血漿丙種球蛋白Fc段唾液酸化水平及其臨床意義［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2009，13( 9) : 4.

［3］Lawrie CH.MicroRNAs and haematology: small molecules，big function［J］.Br J Haematol，2007，137( 6) : 503-512.

［4］Lim LP，Lau NC，Grimson A，et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs ［J］.Nature，2005，433( 7027) : 769-773.

［5］Wheeler DL.Database resources of the National Center for Biotechnology Information［J］.Nucleic Acids Res，2007，15( 7) : 73-85.

［6］Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18( 10) : 997-1006.

［7］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105( 30) : 10513-10518.

［8］Valadi H，Ekstrm K，Bossios A，et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells［J］.Nat Cell Biol，2007，9( 6) : 654-649.

［9］Hsu FC，Shapiro MJ，Chen MW，et al.Immature recent thymic emigrants are eliminated by complement［J］.J Immunol，2014，193( 12) : 6005-6015.

［10］Biesen R，Demir C，Barkhudarova F，et al.Sialic acid-binding Iglike lectin 1 expression in inflammatory and resident monocytes is a potential biomarker for monitoring disease activity and success of therapy in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，2008，58( 4) : 1136-1145.

［11］Angata K，Nakayama J，F(xiàn)redette B，et al.Human STX polysialyltransferase forms the embryonic form of the neural cell adhesion molecule: tissuespecific expression，neurite outgrowth，and chromosomal localization in comparison with another polysialyltransferase，PST［J］.J Biol Chem，1997，272( 11) : 7182-7190.

［12］Kjeldsen E，Roug AS.A novel unbalanced de novo translocation der( 5) t( 4; 5) ( q26; q21.1) in adult T-cell precursor lymphoblastic leukemia［J］.Mol Cytogenet，2012，5( 1) : 21.

［13］Angata K，Suzuki M，F(xiàn)ukuda M.Differential and cooperative polysialylation of the neural cell adhesion molecule by two polysialyltransferases，PST and STX［J］.J Biol Chem，1998，273( 43) : 28524-28532.

［14］Angata K，Suzuki M，Mc Auliffe J，et al.Differential biosynthesis of polysialic acid on NCAM and oligosaccharide acceptors by three distinct a2，8-sialyltransferases，PST ( ST8Sia-IV)，STX ( ST8Sia-Ⅱ)，and ST8Sia-Ⅲ［J］.J Biol Chem，2000，275( 24) : 18594-18601.

［15］Yeh J，Cummings RD.Differential recognition of glycoprotein acceptors by terminal glycosyltransferases［J］.Glycobiology，1997，7 ( 2) : 241-251.

［16］Valadi H，Ekstrm K，Bossios A，et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells［J］.Nature Cell Biology，2007，9( 6) : 654-659.

收稿日期:( 2015-04-20)

通信作者簡介:陳曉翔( 1952-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為為系統(tǒng)系紅斑狼瘡發(fā)病機制。E-mail: xiaoxiang0721@126.com

作者簡介:第一涂洋( 1988-)，男，碩士研究生，研究方向為系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制。E-mail: tuyangzzu@126.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( 81273306)。

文章編號:1002-266X( 2015)30-0017-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R593

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.006