花色素對白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖的影響

譚利利，徐俊英，龔　珂，蘇　圣，張玉敏，朱文慧，侯毅鞠

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林　132013)

·論著·

花色素對白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞增殖的影響

譚利利，徐俊英，龔珂，蘇圣，張玉敏，朱文慧，侯毅鞠*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林132013)

摘要：目的研究花色素對人紅白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)增殖的影響,探討花色素抗腫瘤作用。方法取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，分為陰性對照組、不同濃度K562組及陽性對照組進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過鏡下觀察花色素對K562細(xì)胞生長狀態(tài)的影響；通過繪制K562細(xì)胞生長曲線、噻唑藍(lán)(MTT)比色法、瑞氏染色觀察花色素對K562細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果細(xì)胞加藥處理后，鏡下觀察加藥組細(xì)胞分散，胞體減小，死亡細(xì)胞明顯增多；瑞氏染色,光學(xué)顯微鏡觀察加藥組細(xì)胞形態(tài)明顯改變，胞體大小不一，胞質(zhì)濃染，核漿比例減小，趨于分化成熟，可見中晚幼細(xì)胞；MTT結(jié)果證實(shí)，隨著花色素濃度從25 μg/mL增加到200μg/mL，細(xì)胞生長抑制率逐漸增加，并呈濃度和時(shí)間依賴性。結(jié)論花色素能夠抑制 K562 細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：花色素；K562細(xì)胞；細(xì)胞增殖

文章編號：1673-2995(2015)02-0095-03

中圖分類號：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：識碼： A

Abstract:ObjectiveTo study the antitumor effect of anthocyanin on human leukemia cell (K562). MethodsK562 cells in logarithmic growth phase were divided into different groups and the cells growth pattern in different groups were observed through microscope.The cell growth curve of K562 were measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and the changes of cell morphology in different groups were observed by Wright’s staining.The above methods were used to estimated the effects of anthocyanin on proliferation of K562 cells. ResultsCells were observed under the microscope after dosing.With dispersion,the cell body decreased,dead cells increased significantly.Wright's staining showed that the dosing group cells morphology changed obviously,the cell body vary in size,cytoplasmic dense staining,nucleocytoplasmic ratio decreasing and tending to the differentiation and maturation,and the middle and late immature cells were visible.The MTT results confirmed that with the anthocyanin concentration increased from 25 μg/mL to 200 μg/mL,the cell growth inhibition rate increased in dose and time dependent manner. Conclusion Anthocyanidin can inhibit the proliferation of K562 cells.

基金項(xiàng)目：吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目.

作者簡介：譚利利(1990-)，女(瑤族)，本科在讀.

通訊作者：侯毅鞠(1974-)，女(漢族)，副教授,碩士.

收稿日期：( 2014-08-17)

Proliferation inhibition of anthocyanin on leukemia cell K562

TAN Lili,XU Junying,GONG Ke,SU Sheng,ZHANG Yumin,ZHU Wenhui,HOU Yiju*(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

Key words: flower pigment,K562 cell,cell proliferation

K562細(xì)胞是一種分化極差、惡性程度較高的人紅白血病細(xì)胞株。研究證明，其在體外可被多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，可分別向紅系、粒系、單核巨嗜細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系分化[1-3]?；ㄉ厥且活惙植际謴V泛的植物色素，具有類黃酮的典型結(jié)構(gòu)[4]。有研究表明，花色素對人乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用。其作用機(jī)制與抗氧化作用、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和分化等有關(guān),且對機(jī)體無明顯不良反應(yīng)[5]。本研究通過體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，觀察花色素對K562細(xì)胞的形態(tài)變化，探討花色素對K562細(xì)胞關(guān)于增殖方面的作用，為臨床上白血病的治療提供新思路。

1材料與方法

1.1　材　料

花色素(購自上?；菡\責(zé)任有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT試劑盒(武漢博士生物工程有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱購于美國Forma Scientific公司;倒置相差顯微鏡(Olympus公司);96孔培養(yǎng)板(美國Falcon公司);流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司);自動酶標(biāo)儀(BIORAD公司550型)。

K562細(xì)胞為吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院細(xì)胞室凍存細(xì)胞,接種K562細(xì)胞于含10%新生牛血清的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)傳代培養(yǎng)K562細(xì)胞至對數(shù)生長期，將對數(shù)生長期細(xì)胞分成5組，以每孔1×105接種于96孔板中，24 h后分別加入花色素，使終濃度分別為25、50、100、200 mg/L，并設(shè)置對照組，培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。

1.3　瑞氏染色觀察

常規(guī)傳代培養(yǎng)K562細(xì)胞至對數(shù)生長期，將對數(shù)生長期細(xì)胞分成5組，24 h后分別加入花色素使終度分別為25、50、100、200 mg/L，并設(shè)置對照組，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，離心800 r/min，5 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀涂布于載玻片上，甲醇固定10 min后取出，PBS沖洗，自然晾干，滴加瑞氏染液1 min后再加入等量的PBS，混勻，靜置5 min后，細(xì)流水洗，吸干，鏡檢觀察并拍照。

1.4　MTT法檢測

取對數(shù)生長期K562細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，濃度為1×105/mL，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，加入不同濃度的花色素使終濃度分別為25、50、100、200 mg/L，每一濃度均設(shè)4個復(fù)孔，并設(shè)對照及凋零孔，分別在加藥24、48、72 h后加入MTT溶液10 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，離心1 000 r/min，5 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL Formazan溶解液，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下測各孔吸光度，按下列公式計(jì)算抑制率。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　花色素對K562生長的影響

細(xì)胞加藥處理后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)花色素對K562細(xì)胞的生長有抑制作用，與對照組相比，加藥組細(xì)胞分散，體積縮小，胞體減小，死亡細(xì)胞增多且明顯(見圖1)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的花色素對K562細(xì)胞的生長均有抑制作用,呈濃度和時(shí)間依賴性(見圖2)。

對照組　　　　　　　花色素組

圖 2　K562細(xì)胞生長曲線

2.2　瑞氏染色

收集各組細(xì)胞涂片，瑞氏染色光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組細(xì)胞形態(tài)明顯改變，胞體大小不一，不規(guī)則，胞質(zhì)濃染，核漿比例減小，趨于分化成熟，可見中晚幼細(xì)胞(見圖3)。

對照組　　　　　　　花色素組

2.3　花色素對K562細(xì)胞的生長抑制率作用

MTT結(jié)果證實(shí)，花色素能夠明顯抑制K562細(xì)胞生長，且有濃度依賴關(guān)系。隨著濃度從25 μg/mL增加到200 μg/mL，對細(xì)胞生長抑制率也逐漸增加(見圖4)。

圖 4　不同濃度的花色素對K562細(xì)胞的抑制作用

3結(jié)論

人紅白血病K562細(xì)胞是一株惡性程度較高的人紅白血病體外細(xì)胞系，但在體外可被多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)發(fā)生凋亡、分化和增殖抑制。因此K562細(xì)胞是臨床和基礎(chǔ)領(lǐng)域中篩選新的抗腫瘤藥物和研究調(diào)控胚胎型和胎兒型珠蛋白基因表達(dá)的分子機(jī)制的常用模型[6]。有研究表明K562細(xì)胞能向紅系發(fā)展而且K562細(xì)胞的血紅蛋白合成是和其細(xì)胞不同程度的增殖誘導(dǎo)相聯(lián)系的，而這種增殖誘導(dǎo)則取決于誘導(dǎo)劑的性質(zhì)。

用25~200 μg/mL的花色素處理人紅白血病K562細(xì)胞后，通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。繪制的生長曲線也顯示隨著加入物濃度及時(shí)間的增長，細(xì)胞數(shù)逐漸減少。應(yīng)用MTT比色法等檢測發(fā)現(xiàn)花色素在體外可抑制K562細(xì)胞生長，并呈時(shí)間-劑量依賴性。

據(jù)國外統(tǒng)計(jì)，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國中，歐洲和北美發(fā)病率最高死亡率為3.2~7.4/10萬人口。亞洲和南美洲發(fā)病率較低，死亡率為2.8~4.5/10萬人口。因此，開發(fā)研究出一種天然高效的抗腫瘤藥物是極具意義的。花色素具有一定的增殖抑制效應(yīng)，同時(shí)本研究也表明其對K562細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的抑制作用，提示該藥具備較好的應(yīng)用前景。

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