單寧和聚乙二醇對(duì)綿羊和山羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響

李大彪 張梅梅 于永強(qiáng) 李紅磊 塔 娜 邢媛媛 王衛(wèi)云（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

單寧和聚乙二醇對(duì)綿羊和山羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響

李大彪 張梅梅 于永強(qiáng) 李紅磊 塔 娜 邢媛媛 王衛(wèi)云
（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018）

摘 要：本文旨在研究飼糧中添加不同水平的單寧和高單寧飼糧條件下添加聚乙二醇（PEG）對(duì)綿羊和山羊瘤胃纖維降解菌數(shù)量的影響。試驗(yàn)選用1．5歲、體重約45 kg、安裝永久性瘤胃瘺管的綿羊和絨山羊各4只，采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分4期進(jìn)行。第1期飼喂基礎(chǔ)飼糧（Ⅰ組），第2期在基礎(chǔ)飼糧中添加2%的單寧（Ⅱ組），第3期在基礎(chǔ)飼糧中添加6%的單寧（Ⅲ組），第4期在基礎(chǔ)飼糧中添加6%單寧＋12%PEG（Ⅳ組）。每期試驗(yàn)30 d，其中預(yù)試期12 d，正試期18 d。每個(gè)正試期第1天，采集綿羊和山羊瘤胃內(nèi)容物，測(cè)定瘤胃液pH、氨態(tài)氮（NH3?N）和菌體蛋白（MCP）濃度；運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)固相、液相及全食糜中所附著的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明：1）與Ⅰ組相比，添加6%單寧顯著降低了山羊瘤胃液NH3?N濃度和綿羊瘤胃液MCP濃度（P＜0．05）。添加6%單寧＋12%PEG后，這2個(gè)指標(biāo)恢復(fù)至與Ⅰ組相當(dāng)?shù)乃健?）與Ⅰ組相比，添加6%單寧顯著降低了綿羊和山羊瘤胃固相、綿羊瘤胃液相白色瘤胃球菌數(shù)量（P＜0．05）；添加2%和6%單寧顯著降低了綿羊和山羊固相黃色瘤胃球菌數(shù)量（P＜0．05），添加6%單寧顯著降低了綿羊和山羊瘤胃液相黃色瘤胃球菌數(shù)量（P＜0．05）；添加6%單寧顯著降低了綿羊和山羊瘤胃固相、綿羊全食糜產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量（P＜0．05）。添加6%單寧＋12%PEG后，綿羊和山羊瘤胃這3株纖維降解菌數(shù)量恢復(fù)至Ⅰ組水平或高于Ⅰ組。由此可見(jiàn)，飼糧單寧添加量達(dá)到6%時(shí)降低了瘤胃液NH3?N的濃度，影響MCP的合成，抑制瘤胃固相纖維降解菌的增殖；添加PEG可以削弱單寧對(duì)瘤胃纖維降解菌生長(zhǎng)的負(fù)面影響，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)螌?；聚乙二醇；纖維降解菌；綿羊；山羊

內(nèi)蒙古自治區(qū)是畜牧業(yè)大省，綿羊和山羊存欄數(shù)居全國(guó)首位。近年，由于過(guò)度放牧造成土地沙化、荒漠化日益嚴(yán)重，所以飼養(yǎng)方式正在由傳統(tǒng)放牧向舍飼或半舍飼過(guò)渡。我國(guó)北方地區(qū)灌木植被較豐富，且具有蛋白質(zhì)含量高、分布廣、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，將它們開(kāi)發(fā)為反芻動(dòng)物飼料將有助于解決舍飼和半舍飼條件下我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源緊缺的問(wèn)題。但鑒于多數(shù)灌木植被中含有大量單寧，單寧作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響反芻動(dòng)物瘤胃正常發(fā)酵，降低纖維物質(zhì)的分解及蛋白質(zhì)的消化吸收。飼料中的單寧可以通過(guò)形成難消化的單寧－蛋白質(zhì)復(fù)合物和降低消化酶的活性來(lái)影響蛋白質(zhì)的消化［1］。前人研究表明，單寧對(duì)動(dòng)物的負(fù)效應(yīng)主要發(fā)生在胃腸道微生物區(qū)系層面［2－3］。針對(duì)單寧的抗?fàn)I養(yǎng)和毒性作用，科研人員進(jìn)行了大量的研究，設(shè)法屏蔽或消除飼料中單寧的毒副作用。近年來(lái)，單寧吸附劑———聚乙二醇（PEG）在國(guó)內(nèi)外被廣泛用來(lái)進(jìn)行單寧毒性的定性研究和屏蔽單寧對(duì)家畜營(yíng)養(yǎng)代謝的副作用。Foley等［4］研究表明，添加PEG能夠提高綿羊?qū)帡l飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，這主要是因?yàn)镻EG同單寧競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而減弱了單寧對(duì)酶和微生物活性的抑制作用，大大提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的消化率和利用率。Motubatse［5］研究表明，在山羊放牧前補(bǔ)飼PEG可大大增加山羊?qū)螌幒扛叩拇至系淖杂刹墒沉?。楊加豹等?］研究表明，添加10%PEG處理的刺槐葉粉可完全消除單寧的不利作用。雖然前人在PEG屏蔽單寧毒副作用方面開(kāi)展了大量研究，但是單寧對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響如何？添加PEG后可以提高動(dòng)物對(duì)富含單寧飼料的采食量和消化率是否是由于其促進(jìn)了瘤胃微生物的增殖？這方面前人報(bào)道較少。為此，本研究測(cè)定了在添加2%、6%的單寧以及添加6%單寧＋12% PEG后綿羊和山羊瘤胃液pH、氨態(tài)氮（NH3?N）和菌體蛋白（MCP）的變化規(guī)律，并利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT?PCR）方法定量檢測(cè)了綿羊和山羊瘤胃固、液相［7］以及全混合食糜中附著的3株優(yōu)勢(shì)纖維降解菌———白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus，R．a(chǎn)lbus）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefa? ciens，R．flavefaciens）、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌（Fibrobact?er succinogenes，F(xiàn)．succinogenes）的數(shù)量變化，以期從瘤胃微生物的角度來(lái)探明單寧影響綿羊和山羊?qū)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化機(jī)制，為開(kāi)發(fā)富含單寧的非常規(guī)飼料資源提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用體況良好的1．5歲、體重約45 kg、安裝永久性瘤胃瘺管的蒙古綿羊和內(nèi)蒙古白絨山羊各4只。試驗(yàn)動(dòng)物按照維持需要的1．2倍飼養(yǎng)，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［8］。試驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一驅(qū)蟲(chóng)，單籠飼養(yǎng)。

1．1．2 基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物飼喂精粗比為30∶70的基礎(chǔ)飼糧。粗料為青干草，精料為商品羊育肥料（內(nèi)蒙古正大有限公司）。試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次，自由飲水?；A(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，飼糧中干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物（OM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、鈣（Ca）和磷（P）的含量按照張麗英［9］的方法測(cè)定。

表1　基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Nutrient levels of the basal diet（air?dry basis）　%

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分4期進(jìn)行，每期試驗(yàn)30 d，其中預(yù)試期12 d，正試期18 d。在正試期的第1天晨飼后6 h采集瘤胃內(nèi)容物測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù)和纖維降解菌的數(shù)量。試驗(yàn)包含4組，分別為Ⅰ組（對(duì)照組，第1期）、Ⅱ組（第2期）、Ⅲ組（第3期）和Ⅳ（第4期）。Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅱ組和Ⅲ組在飼喂基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別額外添加占采食量2%和6%的單寧，Ⅳ組在飼喂基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上額外添加占采食量6%單寧＋12% PEG。

1．3 單寧與PEG的添加方法

單寧（相對(duì)分子質(zhì)量1 701．2）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，根據(jù)動(dòng)物每日的采食量將單寧按添加水平稱量后均勻混合到每日投喂的精料中供動(dòng)物采食，待精料全部采食完再投喂粗料。PEG（相對(duì)分子質(zhì)量4 000）購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司。前人和本課題組前期研究均指出，PEG的添加量為單寧添加量的2倍時(shí)屏蔽單寧毒副作用的效果最佳［10－11］，為此本研究中Ⅳ組PEG的添加量為12%。PEG的投喂方式與單寧相同。

1．4 測(cè)定指標(biāo)與樣品制備

1．4．1 測(cè)定指標(biāo)

測(cè)定綿羊和山羊瘤胃液pH、NH3?N和MCP濃度；采用RT?PCR技術(shù)測(cè)定綿羊和山羊瘤胃固、液相及全食糜中附著的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量。

1．4．2 瘤胃內(nèi)容物的采集與樣品的制備

在每個(gè)正試期第1天，晨飼6 h后從試驗(yàn)動(dòng)物瘤胃腹囊中采集瘤胃內(nèi)容物，攪拌均勻用于測(cè)定pH；將部分瘤胃內(nèi)容物迅速分裝于凍存管內(nèi)（定義為全食糜），剩余瘤胃內(nèi)容物迅速經(jīng)4層紗布過(guò)濾，將殘?jiān)ǘx為固相）和濾液（定義為液相）分裝于自封袋和凍存管內(nèi)，在液氮中速凍后置于－80℃保存，用于纖維降解菌定量。其余濾液經(jīng)4 000 r／min，離心15 min，取0．5 mL瘤胃液加到預(yù)先裝有9．5 mL 0．2 mol／L鹽酸的玻璃瓶中，用于NH3?N濃度測(cè)定。剩余瘤胃液用于測(cè)定MCP濃度。NH3?N和MCP待測(cè)樣品均－20℃保存。

1．5 指標(biāo)測(cè)定方法

1．5．1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定方法

pH使用pHS－2型酸度計(jì)測(cè)定；NH3?N濃度參照馮宗慈等［12］提出的比色法進(jìn)行測(cè)定；MCP濃度參照Bradford［13］提出的考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。

1．5．2 瘤胃微生物總DNA的提取

采用珠磨硯法提取瘤胃液微生物總DNA，本方法的關(guān)鍵步驟是玻璃珠的用量和振蕩破碎細(xì)胞及蛋白質(zhì)的去除。用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）使蛋白質(zhì)變性，變性時(shí)間確定為15 min，目的是使蛋白質(zhì)徹底變性并完全去除，從而提高DNA產(chǎn)物的純度。加入氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提時(shí)，靜置時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)，以便離心后液面分界更加清晰，更容易吸取上清，避免蛋白質(zhì)污染。

1．5．3 3株纖維降解菌的引物設(shè)計(jì)與合成

引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2，委托上海生工生物股份有限公司合成。

表2　瘤胃纖維降解菌的PCR引物Table 2 PCR primers for ruminal cellulolytic bacteria

1．5．4 目的片段的擴(kuò)增

反應(yīng)體系25 μL：模板（粗提總DNA）2 μL，Priemix Taq（TaKaRa Taq Version 2．0 plus dye）12．5 μL，目標(biāo)基因上游引物、下游引物（10 μmol／L）各1 μL，雙蒸水8．5 μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54～57℃（退火溫度根據(jù)擴(kuò)增目的基因不同采用不同溫度，表2）退火40 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72℃8 min，4℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果并拍照，將目的片段用膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen公司）進(jìn)行回收。

1．5．5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

按照pGM?T克隆試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行連接，連接體系10 μL：10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase（3 U／μL）1 μL，pGM?T載體（50 ng／μL）1 μL，回收產(chǎn)物3 μL，雙蒸水4 μL。16℃過(guò)夜連接后，取5 μL連接產(chǎn)物加到50 μL TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃水浴熱激90 s，再冰浴2～3 min，加入500 μL的37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，150 r／min、37℃振蕩培養(yǎng)45 min。取100 μL菌液涂于加有Amp、X?gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。

1．5．6 陽(yáng)性質(zhì)粒的篩選及鑒定

挑取藍(lán)色菌斑周?chē)膯蝹€(gè)白色菌斑接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50～100 μg／mL氨芐青霉素）里，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行菌落PCR測(cè)定，鑒定為陽(yáng)性菌落的送檢測(cè)序。測(cè)序工作委托華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行。將陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果在NCBI的Blast上比對(duì)分析，驗(yàn)證正確的菌液，用美國(guó)Axygen公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)品。

1．5．7 RT?PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

提取的質(zhì)粒用酶標(biāo)儀測(cè)定核酸濃度，并檢驗(yàn)質(zhì)粒的提取純度，根據(jù)下列公式計(jì)算出質(zhì)?？截悢?shù)，制備標(biāo)準(zhǔn)品。

質(zhì)粒拷貝數(shù)（個(gè)／μL）＝［6．02×1023（個(gè)／mol）×DNA（ng／μL）］／｛DNA長(zhǎng)度（bp）×660［g／（mol·bp）］｝［16］。

然后用已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒以10倍濃度梯度稀釋至少5個(gè)梯度，每梯度3個(gè)重復(fù)進(jìn)行RT?PCR，同時(shí)用無(wú)酶水做陰性對(duì)照，根據(jù)RT?PCR儀（美國(guó)Illumina公司）的Eco軟件獲得質(zhì)?？截悢?shù)和循環(huán)閾值（Ct）對(duì)應(yīng)的線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．5．8 3株纖維降解菌RT?PCR檢測(cè)

制作質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的PCR條件和待測(cè)樣品RT?PCR條件一致，反應(yīng)體系均為25 μL。定量前將樣品濃度統(tǒng)一稀釋至10 ng／μL，每個(gè)反應(yīng)體系中加入同Priemix Taq相同量的熒光染料SYBR GreenⅡ。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。同時(shí)，每次反應(yīng)都設(shè)空白對(duì)照并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將Ct代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得細(xì)菌拷貝數(shù)。固相、液相、全食糜中3株纖維降解菌拷貝數(shù)的計(jì)算公式如下：

細(xì)菌拷貝數(shù)（個(gè)／mL或個(gè)／g）＝（MQ×C×VD）／（S×V）［17］。

式中：MQ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct計(jì)算得到的細(xì)菌拷貝數(shù)（個(gè)）；C為樣品總DNA濃度（ng／μL）；VD為溶解提取的總DNA的雙蒸水的體積（μL）；S為用于RT?PCR的DNA的量（ng）；V為瘤胃液相（mL）或者固相（g）、全食糜內(nèi)容物（g）樣品的用量。

細(xì)菌數(shù)最終用細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)［lg（個(gè)／g）或lg（個(gè)／mL）］表示。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SAS 8．0軟件包中的ANOVA過(guò)程進(jìn)行方差分析，多重比較用Duncan氏法。以P＜0．05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié) 果

2．1 3株纖維降解菌的菌液PCR檢測(cè)

目標(biāo)片段在膠回收之后進(jìn)行克隆，挑取得單克隆菌落于液體培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜之后，進(jìn)行PCR檢測(cè)，被確證為目的片段后送檢測(cè)序，菌液PCR結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)條帶位置與預(yù)期PCR產(chǎn)物片段大小一致。

2．2 陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆插入片段的測(cè)序，結(jié)果表明陽(yáng)性克隆片段與白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的片段同源性很高（92%～100%），且包含完整的引物序列，說(shuō)明成功構(gòu)建了有目的片段的質(zhì)粒，該質(zhì)?？捎糜谫|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。

圖1　3株纖維降解菌的菌液PCR檢測(cè)Fig．1 PCR detection of the three cellulolytic bacteria in bacterial liquid

2．3 質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)已知拷貝數(shù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍的連續(xù)梯度稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋梯度作為模板進(jìn)RT?PCR。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，Ct為橫坐標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，這3株優(yōu)勢(shì)瘤胃纖維降解菌的斜率為－0．336 5～－0．216 4，相關(guān)系數(shù)大于0．993，擴(kuò)增效率在94%～112%之間，符合RT?PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，引物特異性較高。

2．4 不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

從表3可以看出，綿羊和山羊瘤胃液pH組間無(wú)顯著差異（P＞0．05）。山羊Ⅲ組的瘤胃液NH3?N濃度顯著低于Ⅰ組（P＜0．05），綿羊Ⅲ組的NH3?N濃度與Ⅰ組相比有降低的趨勢(shì)（P＞0．05）。綿羊Ⅱ組和Ⅲ組的瘤胃液MCP濃度顯著低于Ⅰ組（P＜0．05），山羊Ⅱ組和Ⅲ組的MCP濃度也均低于Ⅰ組（P＞0．05）。添加PEG的Ⅳ組瘤胃液NH3?N和MCP濃度都高于單寧添加組，其中綿羊和山羊NH3?N濃度均顯著高于Ⅲ組（P＜0．05），MCP濃度Ⅳ組相對(duì)于Ⅱ組和Ⅲ組有所回升。綿羊和山羊之間比較，除Ⅱ組山羊瘤胃液MCP濃度顯著高于綿羊（P＜0．05）外，瘤胃液pH、NH3?N和MCP濃度均無(wú)顯著差異（P＞0．05）。

圖2　3株纖維降解菌質(zhì)粒的RT?PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2 Standard curves of plasmids of the three cellulolytic bacteria for RT?PCR

表3　不同水平單寧和高單寧飼糧中添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of different levels of tannin and high tannin diets supplemented with PEG on ruminal fermentation parameters in sheep and goats

2．5 不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃白色瘤胃球菌數(shù)量的影響

從表4可以看出，添加單寧后綿羊瘤胃固相、全食糜、液相白色瘤胃球菌的數(shù)量均下降，其中液相Ⅱ組和Ⅲ組均顯著低于Ⅰ組（P＜0．05），固相Ⅲ組顯著低于Ⅰ組（P＜0．05）。添加單寧后山羊瘤胃固相和液相白色瘤胃球菌的數(shù)量低于Ⅰ組，其中固相Ⅱ組和Ⅲ組與Ⅰ組差異顯著（P＜0．05）。綿羊和山羊之間比較，Ⅱ組和Ⅲ組綿羊瘤胃固相白色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于山羊（P＜0．05），Ⅳ組綿羊全食糜和液相白色瘤胃球菌的數(shù)量均顯著高于山羊（P＜0．05）。添加PEG綿羊固相、全食糜、液相白色瘤胃球菌的數(shù)量均有所升高，Ⅳ組均顯著高于Ⅲ組（P＜0．05），Ⅳ組全食糜中的數(shù)量顯著高于Ⅱ組（P＜0．05）。山羊固相白色瘤胃球菌的數(shù)量Ⅳ組顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0．05）。

2．6 不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃黃色瘤胃球菌數(shù)量的影響

從表5可以看出，添加單寧后綿羊和山羊瘤胃固相和液相黃色瘤胃球菌的數(shù)量均下降，其中固相Ⅱ組和Ⅲ組顯著低于Ⅰ組（P＜0．05），液相Ⅲ組顯著低于Ⅰ組（P＜0．05）。綿羊和山羊之間比較，Ⅳ組綿羊瘤胃液相黃色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于山羊（P＜0．05），而固相則為山羊顯著高于綿羊（P＜0．05）。添加PEG后綿羊固相和全食糜、山羊固相黃色瘤胃球菌的數(shù)量均顯著高于單寧添加組（P＜0．05）；液相黃色瘤胃球菌的數(shù)量隨著單寧添加水平的升高而下降，且添加PEG后液相黃色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于6%單寧添加組。

2．7 不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量的影響

從表6可以看出，添加單寧后綿羊瘤胃固相和全食糜，山羊瘤胃固相、全食糜和液相產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量均下降，其中綿羊和山羊固相Ⅱ組和Ⅲ組均顯著低于Ⅰ組（P＜0．05）；綿羊全食糜Ⅲ組、山羊Ⅱ組顯著低于Ⅰ組（P＜0．05）。綿羊和山羊之間比較，Ⅰ組綿羊液相產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量顯著高于山羊（P＜0．05），Ⅳ組綿羊固相顯著低于山羊（P＜0．05）。添加PEG后綿羊和山羊瘤胃固相和全食糜產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量均顯著升高（P＜0．05），且綿羊全食糜、山羊固相和全食糜產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量添加PEG組達(dá)到了Ⅰ組的水平或高于Ⅰ組。

表4　不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃白色瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 4 Effects of different levels of tannin and high tannin diets supplemented with PEG on ruminal quantity of R．a(chǎn)lbus in sheep and goats

表5　不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃黃色瘤胃球菌數(shù)量的影響Table 5 Effects of different levels of tannin and high tannin diets supplemented with PEG on ruminal quantity of R．flavefaciens in sheep and goats

表6　不同水平單寧和高單寧飼糧添加PEG對(duì)綿羊和山羊瘤胃產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的影響Table 6 Effect of different levels of tannin and high tannin diets supplemented with PEG on ruminal quantity of F．succinogenes in sheep and goats

3　討 論

單寧最主要的負(fù)作用是影響瘤胃微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解［18］。本研究得出山羊6%單寧添加組瘤胃液NH3?N濃度顯著低于Ⅰ組，這與前人的研究結(jié)果是一致的。MCP的合成需要各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，其中瘤胃可利用能源和可利用氮源是其主要限制因素。Smith等［2］研究指出，單寧能與細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響細(xì)菌的增殖。本研究中2%和6%單寧添加組瘤胃液MCP濃度均低于Ⅰ組，一方面可能是由于單寧影響了瘤胃細(xì)菌的生長(zhǎng)，使蛋白質(zhì)分解菌、纖維降解菌等瘤胃細(xì)菌的數(shù)量減少，另外可能是由于瘤胃細(xì)菌數(shù)量的減少直接降低了飼糧中蛋白氮和非蛋白氮的降解，導(dǎo)致可供瘤胃厭氧真菌、纖毛蟲(chóng)和古菌利用的氮源較少，進(jìn)而降低了MCP的產(chǎn)量。同時(shí)，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基礎(chǔ)飼糧中額外添加6%的單寧到試驗(yàn)期第20天左右時(shí)，綿羊與山羊的采食量出現(xiàn)不同程度的下降，精神萎靡，糞便粘稠，尿液渾濁，這與課題組前期研究報(bào)道的連續(xù)采食高比例檸條飼料后試驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn)是一致的［11］，其原因可能是單寧在瘤胃中降解產(chǎn)生的大量低分子酚類(lèi)化合物被瘤胃壁吸收，并在血液和體液中蓄積，影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝。

反芻動(dòng)物可以有效地消化纖維含量高的粗料，主要是得益于瘤胃內(nèi)的纖維降解菌。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧結(jié)構(gòu)會(huì)影響瘤胃內(nèi)纖維降解菌的數(shù)量變化，而不同試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間的降解纖維的菌群也有差異［19］。單寧對(duì)動(dòng)物的抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，單寧與唾液蛋白質(zhì)和口腔黏液反應(yīng)可引起收斂作用，對(duì)腸道產(chǎn)生刺激和系統(tǒng)毒性；其次，單寧會(huì)降低纖維素酶和蛋白水解酶活性，抑制瘤胃纖維降解菌和蛋白質(zhì)降解細(xì)菌的生長(zhǎng)［20］；此外，單寧能沉降蛋白質(zhì)，使消化道中的酶失活，從而降低蛋白質(zhì)的利用率。研究表明，若經(jīng)過(guò)一段時(shí)間適應(yīng)或者接種已經(jīng)適應(yīng)含有單寧飼糧動(dòng)物的瘤胃內(nèi)容物可以使綿羊很好地利用含有單寧的飼糧，而不呈現(xiàn)出負(fù)面效應(yīng)。單寧通常被認(rèn)為是瘤胃微生物生長(zhǎng)的抑制劑［3］。但也有研究表明，飼糧中含有適量的單寧對(duì)于反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能及環(huán)境保護(hù)具有一定的積極作用，如降低蛋白質(zhì)的瘤胃降解率、提高氮的利用率、抑制甲烷的排放、提高肉及乳的品質(zhì)等［21］。Mueller?Har?vey［22］認(rèn)為，植物蛋白質(zhì)最容易與單寧結(jié)合，因此，蛋白質(zhì)的消化率下降是進(jìn)食單寧后的典型反應(yīng)，同時(shí)，也會(huì)影響到碳水化合物和淀粉的降解率。本試驗(yàn)研究得出，飼糧中添加2%和6%的單寧，山羊瘤胃固相白色瘤胃球菌、綿羊和山羊瘤胃固相內(nèi)容物黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量均顯著下降。作者認(rèn)為這一方面可能是由于單寧與飼糧蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的氮源減少，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生了抑制作用。另一方面可能是由于單寧與細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜形成了復(fù)合物，使細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［2］，大大降低纖維降解菌的活性。

針對(duì)單寧的抗?fàn)I養(yǎng)和毒性作用，科研人員研究得出，PEG可以同單寧競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而減弱單寧對(duì)酶和微生物活性的抑制作用。Moujahed等［23］的研究表明，采食了含單寧的飼糧的綿羊，當(dāng)在其食用的營(yíng)養(yǎng)舔磚中添加PEG時(shí)，綿羊瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度同對(duì)照相比顯著增加。金龍［24］研究表明，牧草中的縮合單寧能夠減少瘤胃降解蛋白質(zhì)細(xì)菌的數(shù)量，但添加PEG后，主要蛋白質(zhì)降解菌的數(shù)量迅速增加。Provenza等［25］研究報(bào)道，當(dāng)給綿羊飼喂含不同濃度的單寧飼糧時(shí)，綿羊能對(duì)PEG的攝取量進(jìn)行自我調(diào)控，以消除單寧進(jìn)入體內(nèi)引起的不良反應(yīng)。在放牧條件下，盡管嫩枝條含有更高的蛋白質(zhì)，但綿羊卻喜歡采食粗老的枝條，原因是嫩枝條的單寧含量較高，然而如果補(bǔ)飼PEG，綿羊便會(huì)更愿意采食嫩枝條。這表明PEG對(duì)單寧副作用的屏蔽效應(yīng)影響了綿羊的采食行為［26］。本課題組前期研究表明，按照飼糧單寧含量的2～3倍添加PEG，可以顯著提高綿羊瘤胃液NH3?N、MCP和TVFA濃度，提高氮的代謝率［11］。本研究得出，PEG添加組瘤胃液NH3?N濃度顯著高于6%單寧添加組，MCP濃度相對(duì)于單寧添加組也有所回升；此外，與單寧添加組相比，添加PEG可以顯著增加山羊瘤胃固相內(nèi)容物中白色瘤胃球菌、綿羊和山羊瘤胃固相內(nèi)容物黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量，而且添加PEG組上述纖維降解菌的數(shù)量達(dá)到了與Ⅰ組相似的水平。這一結(jié)果表明，PEG可以削弱單寧對(duì)瘤胃纖維降解菌生長(zhǎng)的負(fù)面影響，促進(jìn)瘤胃細(xì)菌的增殖和瘤胃發(fā)酵。本研究中，試驗(yàn)動(dòng)物是舍飼飼養(yǎng)的，室內(nèi)的溫度、濕度以及各方面飼養(yǎng)條件在4期試驗(yàn)中基本一致，因此，本試驗(yàn)中觀察到的綿羊和山羊4組間瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及瘤胃纖維降解菌數(shù)量的差異主要是由于試驗(yàn)的不同處理所導(dǎo)致的。

不同動(dòng)物的胃腸道微生態(tài)存在差異，因此對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的耐受程度也有區(qū)別。前人報(bào)道，山羊?qū)螌幍哪褪苣芰Ρ染d羊強(qiáng)［27］。山羊在冬、春季節(jié)除了采食一部分易消化的牧草外，它們也會(huì)采食足夠量的灌木來(lái)保證對(duì)富含單寧飼料的習(xí)服。山羊的這種牧食習(xí)性使其具有比綿羊更廣闊的生存空間。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同品質(zhì)的粗料飼糧條件下綿羊和絨山羊瘤胃微生物區(qū)系存在顯著差異，綿羊瘤胃厭氧真菌、原蟲(chóng)的數(shù)量以及纖維素酶活性顯著高于絨山羊，而瘤胃總細(xì)菌和纖維降解菌的數(shù)量則顯著低于絨山羊［28］。本研究得出，飼喂基礎(chǔ)飼糧時(shí)，除綿羊瘤胃液相產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量顯著高于山羊外，2羊種瘤胃內(nèi)3株纖維降解菌數(shù)量無(wú)顯著差異；然而添加2%和6%單寧后，山羊瘤胃固相白色瘤胃球菌數(shù)量顯著低于綿羊，這表明山羊的白色瘤胃球菌可能對(duì)單寧更加敏感，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4　結(jié) 論

①添加單寧降低了瘤胃液NH3?N的濃度，影響瘤胃MCP的合成；添加單寧降低了綿羊和山羊瘤胃固相白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌的數(shù)量。

②添加PEG可以削弱單寧對(duì)纖維降解菌生長(zhǎng)的負(fù)面影響，促進(jìn)3種纖維講解細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，改善瘤胃發(fā)酵狀況。

③添加2%和6%單寧后，山羊瘤胃固相白色瘤胃球菌數(shù)量顯著低于綿羊。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 汪海峰．縮合單寧對(duì)反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)作用［J］．中國(guó)飼料，2004（12）：26－28．

［2］ SMITH A H，ZOETENDAL E G，MACKIE R I．Bac?terial mechanisms to overcome inhibitory effects of di?etary tannins［J］．Microbial Ecology，2005，50（2）：197－205．

［3］ PATRA A K，SAXENA J．Dietary phytochemicals as rumen modifiers：a review of the effects on microbial populations［J］．Antonie van Leeuwenhoek，2009，96 （4）：363－375．

［4］ FOLEY W，IASON G，MAKKAR H．Transdisciplinary studies of plant secondary metabolites：lessons from e?cology for animal science and vice versa［C］／／第七屆草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)際學(xué)術(shù)研討會(huì)文集．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：302－327．

［5］ MOTUBATSE M R，NG’AMBI J W，NORRIS D，et al．Effect of polyethylene glycol 4000 supplementation on the performance of indigenous Pedi goats fed dif?ferent levels of Acacia nilotica leaf meal and ad libi?tum Buffalo grass hay［J］．Tropical Animal Health and Production，2008，40（3）：229－238．

［6］ 楊加豹，徐載春，田育軍．刺槐葉單寧含量及聚乙二醇（PEG）對(duì)單寧抗?fàn)I養(yǎng)作用的影響［C］／／第四屆中國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集．北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2001：69－72．

［7］ 楊金麗，侯先志，高愛(ài)武．蒙古綿羊瘤胃固、液相附著微生物的RT?PCR檢測(cè)［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42 （6）：2126－2132．

［8］ 張宏福．動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)［M］．2版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：361，456．

［9］ 張麗英．飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)［M］．3版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007：48－145．

［10］ SALEM A Z M，ROBINSON P H，EL?ADAWY M M，et al．In vitro fermentation and microbial protein synthesis of some browse tree leaves with or without addition of polyethylene glycol［J］．Animal Feed Sci?ence and Technology，2007，138（3／4）：318－330．

［11］ 劉艷玲．添加PEG對(duì)綿羊檸條日糧采食量、消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響［D］．碩士學(xué)位論文．呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

［12］ 馮宗慈，高民．通過(guò)比色測(cè)定瘤胃液氨氮含量方法的改進(jìn)［J］．內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，1993，21（4）：40－41．

［13］ BRADFORD M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein uti?lizing the principle of protein?dye binding［J］．Analyti?cal Biochemistry，1976，72（1／2）：248－254．

［14］ KOIKE S，KOBAYASHI Y．Development and use of competitive PCR assays for the rumen cellulolytic bac?teria：Fibrobacter succinogenes，Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens［J］．FEMS Microbiolo?gy Letters，2001，204（2）：361－366．

［15］ DENMAN S E，MCSWEENEY C S．Development of a real?time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen ［J］．FEMS Microbiology Ecology，2006，58（3）：572－582．

［16］ LEE C，KIM J，SHIN S G，et al．Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Esch?erichia coli［J］．Journal of Biotechnology，2006，123 （3）：273－280．

［17］ 焦金真，王芃芃，湯少勛，等．瀏陽(yáng)黑山羊胃腸道不同部位重要功能微生物的數(shù)量分布特征研究［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（10）：1590－1599．

［18］ MCSWEENEY C S，PALMER B，BUNCH R，et al．I?solation and characterization of proteolytic ruminal bacteria from sheep and goats fed the tannin－contai?ning shrub legume Calliandra calothyrsus［J］．Applied and Environmental Microbiology，1999，65（7）：3075－3083．

［19］ WEIMER P J，WAGHORN G C，ODT C L，et al．Effect of diet on populations of three species of rumi?nal cellulolytic bacteria in lactating dairy cows［J］．Journal of Dairy Science，1999，82（1）：122－134．

［20］ MIN B R，ATTWOOD G T，MCNABB W C，et al．The effect of condensed tannins from Lotus cornicula?tus on the proteolytic activities and growth of rumen bacteria［J］．Animal Feed Science and Technology，2005，121（1／2）：45－58．

［21］ 徐曉鋒，張力莉．單寧對(duì)反芻動(dòng)物促營(yíng)養(yǎng)作用的研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（12）：2084－2089．

［22］ MUELLER?HARVEY I．Unravelling the conundrum of tannins in animal nutrition and health［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，86（13）：2010－2037．

［23］ MOUJAHED N，KAYOULI C，THEWIS A，et al．Effects of multinutrient blocks and polyethylene glycol 4000 supplies on intake and digestion by sheep fed A?cacia cyanophylla Lindl．foliage?based diets［J］．Ani? mal Feed Science and Technology，2000，88（3／4）：219－238．

［24］ 金龍．紫色達(dá)利菊提取縮合單寧對(duì)大腸桿菌和瘤胃氮代謝以及瘤胃微生物的影響［D］．博士學(xué)位論文．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011．

［25］ PROVENZA F D，BURRITT E A，PEREVOLOTSKY A．Self?regulation of intake of polyethylene glycol by sheep fed diets varying in tannin concentrations［J］．Journal of Animal Science，2000，78（5）：1206－1212．

［26］ TITUS C H，PROVENZA F D，PEREVOLOTSKY A，et al．Supplemental polyethylene glycol influences preferences of goats browsing blackbrush［J］．Journal of Range Management，2001，54（2）：161－165．

［27］ Yá?EZ RUIZ D R，MOUMEN A，MARTíN GARCíA A I，et al．Ruminal fermentation and degra?dation patterns，protozoa population，and urinary pu?rine derivatives excretion in goats and wethers fed di?ets based on two?stage olive cake：effect of PEG sup?ply［J］．Journal of Animal Science，2004，82（7）：2023－2032．

［28］ 李大彪．綿羊和絨山羊采食行為以及對(duì)三種不同粗飼料日糧纖維消化率的比較研究［D］．博士學(xué)位論文．呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007．

（責(zé)任編輯 王智航）

Effects of Tannin and Polyethylene Glycol on Ruminal Cellulolytic Bacteria Quantity in Sheep and Goats

LI Dabiao ZHANG Meimei YU Yongqiang LI Honglei TA Na XING Yuanyuan WANG Weiyun
（College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Author，LI Dabiao，associate professor，E?mail：dkyldb＠imau．edu．cn

Abstract：This paper studied the effects of different dietary tannin levels and high tannin diets supplemented with polyethylene glycol（PEG）on ruminal cellulolytic bacteria quantity in sheep and goats．Four sheep and four cashmere goats aged 1．5 years，weighted 45 kg and fitted with permanent ruminal cannulas were selected as experimental animals．Own control experimental design was used，and the study was conducted in consecu?tive four periods．Animals in the four periods were fed a basal diet（period 1，groupⅠ），and the basal diet supplemented with 2%tannin（period 2，groupⅡ），6%tannin（period 3，groupⅢ）and 6%tannin＋12% PEG（period 4，groupⅣ），respectively．Each period lasted for 30 days consisted of a 12?day pre?test period and 18?day test period．On the 1st day of each test period，ruminal content was collected，rumen fluid pH，and the concentrations of ammonia nitrogen（NH3?N）and microbial protein（MCP）were measured，and real?time PCR was used to quantify R．a(chǎn)lbus，R．flavefaciens and F．succinogenes adherent to solid phase，liquid phase and full chyme．The results showed that as follows：1）compared with groupⅠ，the supplementation of 6% tannin significantly decreased NH3?N concentration in rumen fluid in goats and MCP concentration in rumen fluid of sheep（P＜0．05）．These two indices recovered to the same level with groupⅠafter the supplementa?tion of 6%tannin＋12%PEG．2）Compared with groupⅠ，the supplementation of 6%tannin significantly de?creased the quantity of R．a(chǎn)lbus in solid phase of ruminal content in sheep and goats，and in liquid phase of ru?minal content in sheep（P＜0．05）；the supplementation of 2%and 6%tannin significantly decreased the quan?tity of R．flavefaciens in solid phase of ruminal content in sheep and goats（P＜0．05），and the supplementation of 6%tannin significantly decreased the quantity of R．flavefaciens in liquid phase of ruminal content in sheep and goats（P＜0．05）；the supplementation of 6%tannin significantly decreased the quantity of F．succinogenes in solid phase of ruminal content of sheep and goats，and in full chyme of ruminal content in sheep（P＜0．05）．The quantity of the three cellulolytic bacteria recovered to the same or above level with groupⅠafter the sup?plementation of 6%tannin＋12%PEG．In conclusion，dietary supplementation of 6%tannin can decrease NH3?N concentrations，affect MCP synthesis in rumen fluid，and reduce the quantity of cellulolytic bacteria in rumen；the negative effects of tannin on proliferation of ruminal cellulolytic bacteria were impaired by adding PEG，ruminal fermentation were also improved．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（2）：596?605］

Key words：tannin；polyethylene glycol；cellulolytic bacteria；sheep；goat

作者簡(jiǎn)介：李大彪（1980—），男，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，副教授，博士，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E?mail：dkyldb＠imau．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201822）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011BS0403）

收稿日期：2014－08－04

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．02．032

文章編號(hào)：1006?267X（2015）02?0596?10

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：S826