新鮮血液白細胞計數(shù)參考方法的測量不確定度評定

郭曉俊，　王　青，　宋　穎，　繆穎波，　許　蕾

新鮮血液白細胞計數(shù)參考方法的測量不確定度評定

郭曉俊，王青，宋穎，繆穎波，許蕾

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

摘要：目的探討新鮮血液白細胞計數(shù)參考方法測量不確定度的評定方法和程序。方法用國際臨床血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)推薦的參考方法對新鮮血液樣本進行白細胞計數(shù)；明確整個測定過程中測量不確定度分量來源，根據(jù)國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)《測量不確定度表述指南》(GUM)文件中有關(guān)測量不確定度的評估方法，按A、B兩類不確定度的計算方式對各分量分別進行評定，計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最后取95%可信區(qū)間，計算出擴展不確定度。結(jié)果新鮮血液白細胞計數(shù)的均值為6.71×109/L；合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.097×109/L，取95%可信區(qū)間、包含因子k=2，計算得擴展不確定度為0.19×109/L。結(jié)論新鮮血液白細胞計數(shù)參考方法的測量不確定度主要來源于重疊計數(shù)校正及加樣體積。因此，對血液樣本的加樣稀釋和測定應(yīng)嚴(yán)加控制，確保測量結(jié)果具有較小的不確定度。同時建立了白細胞計數(shù)測量結(jié)果不確定度評估模型，可應(yīng)用于白細胞計數(shù)項目的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化，為常規(guī)檢測系統(tǒng)向參考方法溯源提供有效途徑。

關(guān)鍵詞：白細胞計數(shù)；新鮮血液；參考方法；測量不確定度

Uncertainty evaluation on the reference method of leukocyte counts for fresh bloodGUOXiaojun，WANGQing，SONGYing，MAIOYingbo,XULei

.(ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China)

Abstract：ObjectiveTo study the evaluation method and procedure on the uncertainty of leukocyte counts by reference method for fresh blood. MethodsThe reference method recommended by the International Committee for Standardization in Hematology(ICSH) was used for leukocyte counts. The components of uncertainty were validated. The International Organization for Standardization(ISO) Guide to the Expression of Uncertainty of Measurement (GUM), type A and type B methods were used to evaluate each component. Combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated according to 95% confidence interval. ResultsThe leukocyte counts from fresh blood had the average value of 6.71×109/L. The combined standard uncertainty was 0.097×109/L(95% confidence interval， coverage factor k=2), and the expanded uncertainty was 0.19×109/L. ConclusionsThe main sources of uncertainty are from the overlapped calculation correction and pipetting volume. Therefore, there should be strictly control on pipetting volume in order to make lower uncertainty. The evaluation model of uncertainty is established, which can be applied to the leukocyte counts and standardization, providing effective methods for traceability.

Key words：Leukocyte count；Fresh blood；Reference method； Uncertainty

自1993年國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Standardization Organization，ISO)發(fā)布《測量不確定度表述指南》(GuidetotheExpressionofUncertaintyinMeasurement，GUM)以來，國際上表示測量結(jié)果及其不確定度在術(shù)語定義、概念、評定方法和報告的表達方式方面有了明確、統(tǒng)一的規(guī)定[1]。2002年4月歐洲化學(xué)測量溯源性和質(zhì)量改進網(wǎng)絡(luò)組織(European Chemical Measurement Traceability and Quality Improvement of Network Organization，EURACHEM)和分析化學(xué)國際溯源性合作小組(Chemical Analysis of International Traceability Cooperation Group，CITAC)又共同發(fā)布了《分析測量中不確定度的量化》第2版[2]。由于測量不確定度的概念在我國應(yīng)用時間較短，中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)建議各實驗室要逐步開展測量不確定的評定及應(yīng)用工作，特別是能提供校準(zhǔn)服務(wù)的實驗室必須進行不確定度的評定。我們利用相關(guān)實驗研究數(shù)據(jù)和文獻資料，按GUM中測量不確定度評估方法和EURACHEM/CITAC指南中不確定度的評估方式，對白細胞計數(shù)參考方法進行了測量不確定度的評定。

材料和方法

一、材料

1. 儀器Z2顆粒計數(shù)儀(美國Beckman-Coulter公司)。100、500 μL移液器(美國Drummond公司和德國Brand公司)，20 mL A級容量瓶(德國Brand公司)，主要用于血液樣本的稀釋。

2. 試劑ISOTON II等滲電解質(zhì)溶液和溶血素以及濃度質(zhì)控物(批號7497030)、乳膠標(biāo)準(zhǔn)顆粒CC Size Standard L10[批號9747287，直徑9.805 μm，通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NIST)認證] 均由美國Beckman-Coulter公司提供。

3. 樣本EDTA-K2抗凝新鮮健康人靜脈血標(biāo)本(4 h內(nèi))。去除測定時不能有溶血或有微小凝塊標(biāo)本。

二、被測量技術(shù)規(guī)定

2. 重疊計數(shù)校正測定原理和條件不變。測定流程：按ICSH推薦方法[3]，制備2套，每套制備4份原液白細胞稀釋樣本(0.02 mL+20 mL、0.04 mL+20 mL、0.06 mL+20 mL、0.08 mL+20 mL)，用溶血劑溶解紅細胞，計數(shù)一定體積內(nèi)的細胞數(shù)，重復(fù)檢測次數(shù)分別為12、6、4、3。重疊計數(shù)通過回歸分析方法進行校正[3-5]，使用回歸分析方法來檢查回歸的線性；如分析未顯示非線性，那么回歸直線的交點代表最大濃度原液稀釋樣本(0.08+20 mL)的重疊校準(zhǔn)值。用計數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)得出白細胞的計數(shù)值。用最小二乘法估計得到一元線性回歸方程為y=bx+a。式中y為細胞計數(shù)值、x為稀釋濃度、b為斜率、a為截距。

三、識別不確定度的來源

采用此測量數(shù)學(xué)模型繪制的修正因果關(guān)系圖(魚骨圖)見圖1。

圖1　白細胞計數(shù)的因果關(guān)系圖

四、量化不確定度

識別不確定度來源后，通過A類評定和B類評定方法量化這些不確定度來源所產(chǎn)生的不確定度分量[6，8]。

表1　重疊計數(shù)原始記錄　(×109/L)

五、計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度

在確定和量化了影響測量不確定度合成各分量后，計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度(uc)和擴展不確定度(U)[6-7]。計算公式為

式中urel,c為合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、urel,(xi)為各不確定度分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；k為包含因子，k=2表示正態(tài)分布95%置信概率。

表2　實測值與理論值對應(yīng)關(guān)系表　(×109/L)

=0.014 51；

uc=urel,c×C=0.014 51×6.714×109

=0.097 4×109/L

U=k×uc=2×0.097 4×109=0.19×109/L。

結(jié)果

白細胞計數(shù)參考方法測量中各分量的相對貢獻見圖2。新鮮血液白細胞計數(shù)參考方法測量數(shù)據(jù)及不確定度見表3。本研究新鮮血液白細胞計數(shù)測定結(jié)果為6.71×109/L，U=0.19×109/L(k=2)。

圖2　測量中不確定度各分量相對貢獻

符號不確定度分量量值單位標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度frep測量的重復(fù)性 6.714×109/L0.01850.002752Vsample加樣體積 80μL0.24490.003062Vdilution+Vlytic稀釋體積 20.5mL0.00081890.0003995Vreaction計數(shù)體積 0.5mL0.02040.00408fc重疊計數(shù)校正 6.713×109/L0.089220.01329uc合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度6.714×109/L0.0974/ U擴展不確定度 6.714×109/L0.19/

討論

本研究根據(jù)GUM文件對白細胞計數(shù)參考方法進行不確定度評估，通過建立不確定度評估模型，探討不確定度各分量對測量結(jié)果不確定度的相對貢獻。由表3和圖2可知，重疊計數(shù)校正、計數(shù)體積和加樣體積是影響測量不確定度的主要分量。因此，對稀釋液配制和測量應(yīng)嚴(yán)加控制，確保測量結(jié)果具有較小的不確定度。其中，顆粒計數(shù)儀計數(shù)體積0.5 mL是一個固定因素，無法直接測量，只能由廠商提供數(shù)據(jù)計算。稀釋細胞因素主要受移液器校準(zhǔn)影響，也是一個固有因素，理論上可將偏差減小為零，但在實際工作中操作比較困難，這些因素應(yīng)在操作中予以重視。

對測量不確定度評估是一個很細致的過程，應(yīng)注意質(zhì)量保證，確保檢測過程穩(wěn)定并受控；有合格的操作人員，對儀器和試劑進行正確的維護和校準(zhǔn)；使用經(jīng)確認的分析方法和文件化測量程序，使實驗室檢測結(jié)果具有溯源性。在分析影響因素中，本研究考慮了計量器、測量條件、儀器性能、空白、重復(fù)等幾個分量，但未涉及分析前因素和分析后因素，如采血抽樣、基體效應(yīng)、干擾、質(zhì)量控制、參考區(qū)間等因素。關(guān)于分析前因素和分析后因素對測量不確定度的影響尚需進一步研究探索。

隨我國檢驗醫(yī)學(xué)水平的不斷提高和檢驗工作的日益規(guī)范以及近年來對檢驗標(biāo)準(zhǔn)化工作的逐漸重視，量值溯源、測量不確定度等概念受到越來越多的關(guān)注。血細胞分析溯源存在困難，鑒于國際標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)目前還未建立血細胞分析參考實驗室網(wǎng)絡(luò)，并且建立血細胞分析參考方法的機構(gòu)和參考實驗室全國還不多，除建議常規(guī)檢測實驗室使用定值溯源至參考方法的校準(zhǔn)物作為溯源標(biāo)準(zhǔn)外，還可以使用溯源至參考方法的定值新鮮血作為另一條可行的溯源途徑，這樣有助于解決當(dāng)前血細胞分析溯源的實際問題。以新鮮血作為校準(zhǔn)物是有保存時間和條件限制的，需不同地區(qū)的比對實驗室一起來承擔(dān)建立溯源體系的工作。如何發(fā)揮各地比對實驗室的作用，如何開展比對實驗室質(zhì)量管理和監(jiān)督工作還在探討中[9]。

綜上所述，參考方法測定新鮮血白細胞計數(shù)的測量不確定度主要來源于重疊計數(shù)校正和加樣體積因素。因此，對血樣加樣稀釋和測定應(yīng)嚴(yán)加控制，確保測量結(jié)果有較小的不確定度。同時，本實驗室依據(jù)ICSH推薦方法建立了白細胞計數(shù)參考方法，同時建立了白細胞計數(shù)測量結(jié)果不確定度評估模型，可用于白細胞計數(shù)項目量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化，為常規(guī)檢測系統(tǒng)向參考方法溯源提供有效途徑。

參考文獻

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(本文編輯：龔曉霖)

收稿日期：(2015-02-05)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0512-05R446.1

文獻標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.023

作者簡介：郭曉俊，男，1978年生，碩士，主管技師，主要從事臨床檢驗工作。

基金項目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委會員資助項目(2013ZYJB0010)