PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中沙門菌活菌的研究

於　穎，　王文靜，　陸　曄

PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中沙門菌活菌的研究

於穎1，王文靜2，陸曄2

(1. 東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620； 2. 上海市疾病預防控制中心，上海 200336)

摘要：目的將疊氮溴化丙錠(PMA)與實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)相結合定量檢測畜禽肉類中活的沙門菌。方法通過優(yōu)化光反應時間、PMA濃度等PMA作用條件，建立PMA-qPCR方法，構建重組質粒建立標準曲線，考察該方法的靈敏性、特異性，并將該方法用于定量檢測未經(jīng)增菌培養(yǎng)的畜禽肉類樣品中的沙門菌。結果在PMA濃度為15 μg/mL、曝光5 min的條件下可完全抑制樣品中死菌DNA的擴增。建立的定量標準曲線循環(huán)閾值(Ct值)與質粒標準品模板的拷貝數(shù)呈良好線性關系(r2=0.997 9)，最低可檢出10 拷貝/反應體系。所建立的PMA-qPCR方法最低可檢出21 拷貝/μL沙門菌。采用PMA-qPCR檢測人工染菌雞肉樣品，最低可檢出103CFU/mL沙門菌。結論用PMA-qPCR方法可實現(xiàn)定量檢測畜禽肉類樣品中活的沙門菌，從而達到快速檢測的目的。

關鍵詞：沙門菌；活菌；疊氮溴化丙啶；熒光定量聚合酶鏈反應；畜禽肉類

Research on a quantitative method to detect viableSalmonellaby PMA-qPCR in livestock and poultry meatYUYing1，WANGWenjing2，LUYe2

.(1.CollegeofChemistryandBiochemistry，DonghuaUniversity，Shanghai201620，China； 2.ShanghaiMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention，Shanghai200336，China)

Abstract:ObjectiveTo enumerate Salmonella in meat of livestock and poultry rapidly and accurately by using propidium monoazide(PMA) combined with real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction(qPCR). MethodsThe light exposure time and the concentration of PMA were optimized to establish PMA-qPCR. The standard curve was established by standard plasmid. The sensitivity and specificity were investigated. This method was used for the quantitation determination of Salmonella in livestock and poultry meat. ResultsThe amplification of DNA derived from Salmonella dead cells could be inhibited without affecting the viable cells when PMA was at a dose of 15 μg/mL and exposed for 5 min. The cycle threshold values(Ct) and standard plasmid model cell copy number presented the satisfactory linear， and the correlation coefficient r2approached 0.997 9. This method could detect as low as 10 copies/reaction. The minimum detection level was 21 copies/μL by PMA-qPCR. In artificial chicken samples， PMA-qPCR could detect as low as 103CFU/mL. ConclusionsIt was possible to quantify viable Salmonella in meat of livestock and poultry by PMA-qPCR.

Key words:Salmonella； Viable bacterium； Propidium monoazide； Real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction； Livestock and poultry meat

沙門菌是導致食源性疾病主要的致病菌之一。我國由微生物引起的食源性疾病中，沙門菌占總數(shù)的10.2%，是導致食源性疾病的第2位病原菌，且在食品分類中以畜禽肉類樣品的污染最為嚴重[1-2]。面對不斷出現(xiàn)的食品安全問題，對食品中特別是畜禽肉類中的沙門菌進行準確、有效地檢測，是控制這類食源性疾病發(fā)生并進行有效預防和監(jiān)測的重要條件。

目前，許多分子檢測技術如實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitation polymerase chain reaction，qPCR)、基因芯片、逆轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)等用于食品中目標微生物的定量檢測，相較傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測時效高，花費人力、物力較少[3]。但是大部分分子檢測方法同時檢測樣品中活菌和死菌的DNA，因此不能區(qū)分食品樣品中活菌和死菌，導致出現(xiàn)“假陽性”的結果，對實際監(jiān)測工作意義不大。逆轉錄PCR等雖可檢測活菌，但mRNA極不穩(wěn)定，且對mRNA提取技術的要求非常高，阻礙了在食品樣品檢測中的應用。因此，在實際工作中仍依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行檢測。此外，另一類處于活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable， VBNC)狀態(tài)的細菌[4]與普通細菌一樣具有毒性和致病性，使用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法容易漏檢，因而對食品安全構成的威脅也不容忽視，亟需改進檢測方法，對其進行有效的檢測。

疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種與核酸具有親和性的光敏性染料。它可穿過死亡細胞的破損細胞膜，在強光的誘導下與DNA形成牢固的共價結合，從而抑制DNA擴增；同時，游離的PMA可在強光作用下與溶液中的水分交聯(lián)失活[5]?；罴毎哂型暾募毎ぃ琍MA不能透過細胞膜與DNA反應。我們利用PMA對活/死細胞具有選擇性的特性，將PMA與qPCR相結合檢測沙門菌，對PMA作用于沙門菌的最佳曝光時間以及作用濃度進行摸索，并應用于畜禽肉類樣品。通過建立針對樣品中活的沙門菌檢測方法，規(guī)避原先檢測方法中出現(xiàn)假陽性和漏檢的情況，開發(fā)快速、準確的活菌定量檢測技術。

材料和方法

一、材料和試劑

1. 試驗菌株本研究使用的菌株見表1。ATCC菌株購自美國標準生物品收藏中心，其余菌株為本實驗室收集、鑒定、編號并保存的菌株。

2. 主要試劑和儀器LB培養(yǎng)液(上海市疾病預防控制中心試劑供應研究中心)、PMA(美國Biotium公司)、TaqMan?Environmental Master Mix 2.0(美國Life Technologies公司)；mericon DNA Bacteria Kit(Qiagen公司)、PCR Premix TaqTM試劑(日本TaKaRa公司)、pMDTM18-T Vector Cloning Kit(日本TaKaRa公司)、ABI 7900HT熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)、650 W鹵素燈(德國OSRAM公司)、NanoDrop2000核酸蛋白儀[賽默飛世爾科技(上海)有限公司]。

表1實驗菌株

類別菌株來源沙門菌 鼠傷寒沙門菌ATCC14028腸炎沙門菌ATCC49214非沙門菌阪崎腸桿菌ATCC51329大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單胞菌ATCC27853副溶血弧菌ATCC17802金黃色葡萄球菌ATCC6538宋內志賀菌ATCC11060小腸結腸耶爾森菌Y1單增李斯特菌總68-88大腸埃希菌O157總75-86創(chuàng)傷弧菌總18-85

二、菌液制備

1. 沙門菌培養(yǎng)取鼠傷寒沙門菌標準菌株ATCC 14028接種LB培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋后用營養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)計數(shù)，得到終濃度為6.8×108CFU/mL的純菌液。

2. 死細胞菌液 將已調整濃度的純菌液(菌液濃度為6.8×108CFU/mL)進行熱處理(水浴95℃，10 min)致死，冷卻到室溫，制成死細胞菌液；取1 mL熱處理后的菌液涂布在營養(yǎng)瓊脂平皿37℃培養(yǎng)24 h，營養(yǎng)瓊脂平皿上無菌生長。

三、引物設計和探針制備

以沙門菌invA基因(GenBank: M90846.1)為特異性基因，由生工生物工程(上海)有限公司合成引物和探針，所采用的引物及探針序列見表2。

表2　引物與探針序列

四、細菌DNA提取

取1 mL菌液，10 625×g離心5 min棄上清，加入1 mL滅菌去離子水重懸沉淀，按照細菌DNA提取試劑盒的說明書提取細菌DNA。DNA模板保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

五、常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測

1. 常規(guī)PCR反應體系反應總積體為20 μL。基因組DNA 2 μL作為模板，PCR Premix TaqTMMaster mix 10 μL，引物IM832-F和引物IM832-R終濃度為0.5 μmol/L，ddH2O補足至反應總體積。反應條件為94℃ 5 min預變性，94℃ 1 min變性，62℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共進行35個循環(huán)。

2. qPCR反應體系反應總積體為20 μL?；蚪MDNA 2 μL作為模板，TaqMan?Environ-mental Master mix 10 μL，引物invA-F和引物invA-R終濃度為0.75 μmol/L，探針invA-P終濃度為0.2 μmol/L，ddH2O補足至反應總體積。反應條件為95℃ 5 s，60℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。每個樣品設3個平行。用SDS 2.4軟件分析結果。

六、PMA處理的條件

1. PMA儲存液及工作液配制將PMA染料溶于200 μL 20%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中制成5 μg/μL的儲存液，置-20℃避光長期保存。將PMA儲存液10倍稀釋后作為工作液。

2. 最適PMA的濃度(1)PMA作用的最小濃度：取死菌液500 μL各9份，分別加入PMA工作液，終濃度分別為0、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0和25.0 μg/mL，充分混勻，避光孵育10 min后，按照最佳曝光時間進行光反應；提取菌液DNA，經(jīng)PCR擴增后，研究PMA完全抑制死細胞DNA擴增的最小濃度；(2)不影響活菌擴增的PMA的最大濃度：取活菌液500 μL各6份，分別加入PMA工作液，終濃度為0、10、15、20、25和40 μg/mL，充分混勻，避光孵育10 min后置650 W鹵素燈下按照最佳曝光時間進行光反應；經(jīng)PMA處理的菌液提取基因組DNA后用定量熒光PCR進行檢測，研究PMA不影響活菌DNA擴增的最大濃度。

3. 最適曝光時間取死菌液500 μL各5份，加入PMA工作液，終濃度為15 μg/mL，充分混勻，避光孵育10 min，使PMA與樣品充分反應。然后將樣品平放于冰上，避免受熱過度。置650 W鹵素燈下分別照射1、3、5、7和10 min，樣品距光源20 cm。另將不加入PMA的樣品作為陽性對照。PMA處理后提取DNA，經(jīng)PCR擴增，研究PMA處理的最佳曝光時間。

4. PMA對不同比例活菌/死菌的樣品的檢測效果 將活菌和死菌兩種菌懸液按表3的比例進行混合，各取500 μL作為測試樣品，加入PMA處理后提取DNA進行PMA-qPCR反應，同時以不加PMA處理的樣品作為對照組。

表3　死菌液中活菌的添加比例　(CFU/mL)

七、方法學評價

1.標準曲線的建立根據(jù)沙門菌invA基因完整序列用Oligo 7.0軟件設計含有特異性序列的目的片段，采用局部序列排比檢索基本工具(basic local alignment search tool, BLAST)檢查特異性。引物序列見表2。將含有invA基因的特異性靶序列連接到pMD18-T載體后，轉入大腸埃希菌DH5α感受肽細胞中，篩選陽性克隆菌落，經(jīng)PCR及測序[由生工生物工程(上海)有限公司完成]來鑒定片段序列。提取質粒DNA，用核酸蛋白儀測定質粒DNA的濃度。根據(jù)公式換算成基因的拷貝數(shù)。質粒DNA拷貝數(shù)(拷貝/μL)=DNA濃度/(片段大小×660)×NA(NA為阿伏伽德羅常數(shù)：6.02×1023)。將制備的沙門菌qPCR反應質粒標準品進行10倍梯度稀釋至10-3～10-10，作為標準模板溶液進行熒光定量PCR反應，并繪制標準曲線。

2. PMA-qPCR的靈敏度將菌液作10倍梯度稀釋至100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7分別進行優(yōu)化條件后的PMA處理，再進行PMA-qPCR的靈敏度分析實驗。實驗重復3次。

3. PMA-qPCR的特異性取沙門菌2株、非沙門菌10株(見表1)，經(jīng)培養(yǎng)后的菌液各1 mL進行PMA-qPCR檢測，做特異性分析。

4. 人工染菌樣品檢測取25 g雞肉樣品(已檢測不含沙門菌)加入含有225 mL 胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soya broth yeast, TSBY)的無菌均質袋中，置拍打式均質器上均質2 min，作為雞肉勻漿。分別加入濃度為101～108CFU/mL的鼠傷寒沙門菌菌液，作為人工污染的樣品。染菌樣品采用優(yōu)化條件的PMA處理后提取DNA，進行熒光定量PCR檢測，并在構建的標準曲線上判讀結果，得到各濃度染菌樣品的拷貝數(shù)。同時將其與平皿計數(shù)法結果做比較。

八、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，進行獨立樣品t檢驗、配對t檢驗和多重方差分析Tukey′s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、PMA處理的優(yōu)化結果

1. PMA作用的最小濃度電泳圖譜顯示未加入PMA的樣品出現(xiàn)明亮條帶，隨著PMA濃度的增大，PCR后的電泳條帶逐漸減弱。在PMA濃度為10.0～12.5 μg/mL 時，樣品仍有微弱條帶，說明PMA并沒有完全抑制樣品中DNA的擴增。當PMA濃度增加到15 μg/mL后，電泳條帶消失，樣品中死菌的DNA完全被抑制，不能進行擴增。因此，15 μg/mL PMA可作為抑制樣品中DNA擴增的最小濃度。見圖1。

注：1為Marker(100 bp)；2～9為不同濃度PMA(25.0、20.0、17.5、15.0、12.5、10.0、7.5、5.0 μg/mL)處理后的樣品；10為不加PMA的對照；11為陰性對照

圖1不同濃度PMA對死亡細菌的影響

2. 不影響活菌擴增的PMA的最大濃度在初始階段(0～25 μg/mL)，PMA濃度的增大對活菌影響較小，Ct值為18.05～18.72，ΔCT<1。Tukey′s檢驗顯示在PMA≤25 μg/mL的條件下，各PMA濃度間Ct值無明顯差異(P>0.05)，活菌DNA擴增幾乎不受影響。當PMA濃度增大至40 μg/mL時，Ct值明顯增大(P<0.05)。說明在PMA濃度達到40 μg/mL時對活菌有一定毒性，可抑制活菌DNA的擴增。見表4。

3. PMA光照時間的優(yōu)化經(jīng)650 W鹵素燈照射1、3、5、7和10 min后，經(jīng)PMA處理后的死菌樣品均沒有陽性條帶，而沒有加入PMA的死菌樣品可見明顯條帶，說明曝光1 min以上已可對死菌DNA造成抑制作用。見圖2。

表4不同PMA濃度作對活菌的影響

PMA(μg/mL)Ct值ΔCtP值018.05±1.340/1018.25±1.400.201.001518.56±1.610.510.962018.60±1.170.550.822518.72±0.720.670.954021.33±1.223.280.00

注：ΔCT=不同濃度PMA處理組的Ct值-0 μg/mL組的Ct值

注：1為 Marker(100 bp)；2為未加PMA的死菌樣品(對照)；3～7為加PMA后經(jīng)光反應1、3、5、7和10 min后的死菌樣品

圖2不同光照時間對經(jīng)PMA處理的死菌樣品的影響

4. PMA對與活/死菌的選擇性當樣品中全部是死菌時(活菌比例為0%)，不經(jīng)PMA處理的樣品仍能測得Ct值(22.09±0.20)，而經(jīng)PMA處理的樣品未測得熒光信號，說明樣品中死菌的DNA完全被PMA抑制，不能進行擴增。當活菌比例為1%、10%、25%、50%時，經(jīng)PMA處理的樣品的CT值明顯高于未經(jīng)PMA處理的樣品，即經(jīng)PMA處理的樣品中可擴增的DNA模板數(shù)量少于未經(jīng)PMA處理的樣品。PMA能明顯抑制死菌DNA的擴增。當活菌比例達到100%時，未經(jīng)PMA處理的樣品的Ct值與經(jīng)PMA處理樣品的Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明經(jīng)PMA處理后活菌DNA擴增未受影響。另外，活菌比例的上升趨勢也與ΔCt值減小的趨勢相對應。說明經(jīng)PMA處理后，與不加PMA的對照組比較，PMA處理組的死菌DNA受PMA抑制而不能進行擴增，消除了因死菌DNA擴增造成的干擾，避免了假陽性的發(fā)生。見表5。

表5　不同活菌比例樣品PMA-qPCR結果　值)

注：UD表示未測得；ΔCT=PMA處理組Ct均值-未經(jīng)PMA處理組Ct均值

二、PMA-qPCR定量檢測方法的建立

1. 質粒標準品的制備及標準曲線的建立將構建的重組質粒提取DNA得到沙門菌的質粒DNA。測序后，經(jīng)BLAST比對Genbank中沙門菌invA基因序列符合率達100%。測得質粒DNA的濃度為78 ng/μL，根據(jù)公式得到質粒標準品的原始濃度為2.0×1010拷貝/μL。將重組質粒10倍梯度稀釋，制成濃度范圍為1×101～1×108拷貝/反應體系的標準品溶液。以質粒拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線，見圖3。從標準曲線可以看出重組質粒的拷貝數(shù)與Ct值之間存在對應線性關系，相關系數(shù)(r2)=0.997 9，斜率為-3.254 8，最低可以檢出10拷貝/反應體系的沙門菌。

注：Y=-3.254 8X+43.006,R2=0.997 9

圖3沙門菌qPCR標準曲線

2. PMA-qPCR的靈敏度將10倍稀釋至100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液分別進行PMA-qPCR，經(jīng)標準曲線判讀得到定量結果，見表5(以標準品構建的標準曲線Y=-3.228 1X+43.107 9，r2=0.994 8)。PMA-qPCR最低可檢出21拷貝/μL的沙門菌，見圖4。

表6不同稀釋比例菌液樣品的PMA-qPCR結果

菌液Ct值拷貝/μL10018.30±0.084.8×10710-121.50±0.084.9×10610-224.68±0.135.1×10510-327.74±0.055.8×10410-432.35±0.282.2×10310-534.70±0.324.1×10210-636.37±0.341.2×10210-738.87±0.1221

3. PMA-qPCR的特異性鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的熒光擴增信號指數(shù)期明顯，Ct值為15～25(17.91、21.06)，而其他非沙門菌均未見有明顯擴增，顯示PMA-qPCR方法對沙門菌的檢測特異性高。見圖5。

注：1～8分別為4.8×107、4.9×106、5.1×105、5.8×104、2.2×103、4.1×102、1.2×102、21 拷貝/μL的菌液的擴增曲線

圖4PMA-qPCR的靈敏度分析

圖5　不同細菌PMA-qPCR的檢測結果

三、人工染菌肉類樣品的檢測

對不同菌量人工染菌的雞肉樣品進行PMA-qPCR檢測，并在質粒標準品所建立的標準曲線(Y=-3.148X+43.43，r2=0.995)上得到樣品的拷貝數(shù)。當菌液濃度為101和102CFU/mL時均沒有明顯的擴增信號，記為“陰性”；當菌液濃度為103～108CFU/mL時可測得人工染菌樣品的拷貝數(shù)。將PMA-qPCR與平皿計數(shù)法結果的對數(shù)值進行配對t檢驗，結果顯示在103～108CFU/mL范圍內兩者結果差異無統(tǒng)計學意義(t=1.29，P>0.05)。

表7　人工染菌樣品PMA-qPCR結果與平皿法計數(shù)比較

注：UD表示未測得

討論

根據(jù)文獻報道，PMA對細胞的作用效果與多種因素有關[8]，包括細菌種屬、PMA的曝光時間和濃度、樣品的濁度[9]以及細胞的死亡方式等。本研究采用食品樣品中較常用的高溫滅菌方式處理死亡細菌[10]，并選取了幾個影響PMA作用的關鍵要素：曝光時間、PMA最適濃度等進行實驗，研究PMA對沙門菌活/死菌的篩選作用。研究結果顯示，當PMA濃度≥15 μg/mL時，PMA可完全抑制死菌的擴增；而當PMA>40 μg/mL時會對活菌產生毒性影響。綜合考慮PMA對活菌和死菌的影響作用，選取15 μg/mL PMA作為篩選活菌和死菌的最適濃度，可避免樣品中死菌DNA造成的假陽性干擾，同時也不影響活菌DNA的擴增。另外，在最佳曝光時間的選擇實驗中，PMA在光照1 min后即可抑制樣品中死菌DNA的擴增，但考慮到本研究的實驗對象為食物樣品，其中常存在糖類、有機物質等微小可溶性顆粒物質，造成透光性不足，從而影響PMA與DNA的結合及反應，因此延長PMA光反應時間至5 min，同時也確保溶液中游離的PMA全部被鈍化。通過將活菌和死菌的混合樣品采用優(yōu)化條件(PMA濃度為15 μg/mL、光照5 min)后的PMA進行處理，可排除樣品中死菌DNA的擴增干擾，避免假陽性的發(fā)生，實現(xiàn)PMA對活/死菌的篩選作用。NOCKER等[5]的研究顯示在采用50 μmol/L(25 μg/mL)PMA、光照2 min即可完全抑制DNA擴增，但其檢測目標為純菌。祝儒剛等[11]在PCR實驗中推薦的PMA濃度只有4 μg/mL，遠低于本研究的15 μg/mL，但其實驗所需的光照時間較長(15 min)。另外，許多研究將50 μmol/L PMA作用、光反應5 min作為標準程序應用于食品中沙門菌的qPCR實驗[12-13]。但由于qPCR對模板高度敏感，本研究中進一步討論了可有效抑制死菌DNA擴增且對活菌qPCR不產生影響的最適濃度，最后確定15 μg/mL為PMA的作用濃度。

Taqman探針熒光定量PCR因其快速、靈敏的特點已成為食源性病原微生物檢測和鑒定的重要手段。合適的靶基因是進行熒光定量PCR分析的重要前提。本研究選擇invA基因作為檢測沙門菌的特異性基因，invA基因是單拷貝基因，主要編碼沙門菌侵襲蛋白A，與沙門菌的毒力密切相關，且與其他生物無同源關系[14]，通過對invA基因進行qPCR檢測可得到沙門菌基因組的定量數(shù)據(jù)。此外，qPCR實現(xiàn)對樣品的準確定量需要穩(wěn)定、可靠的標準品以及由其所建立的標準曲線。以克隆質粒作為標準品因其環(huán)狀閉合結構相比基因組DNA更穩(wěn)定，且容易保存，倍受研究者推崇。本研究成功構建了含有沙門菌invA基因特異性靶序列的重組質粒作為標準品，其Ct值和原始拷貝的對數(shù)值呈良好的線性關系，擴增斜率為-3.254 8，即擴增效率為102.88%，在可接受范圍內(90%～105%)，最低能檢測10 拷貝/反應體系，說明所構建的沙門菌質?？勺鳛闊晒舛縋CR的標準品，且因其穩(wěn)定性適合長期使用。本研究采用PMA-qPCR檢測沙門菌純菌樣品，并在PMA的作用下消除了死菌DNA的擴增干擾，其靈敏度和特異性均良好，最低可檢測到21 拷貝/μL。

為了評估PMA-qPCR對肉類樣品的定量檢測，本研究使用人工染菌的雞肉樣品作為模擬樣品。通過在所建立的標準曲線上計算得到樣品的拷貝數(shù)，并將結果與傳統(tǒng)的平皿計數(shù)進行比較，兩者在對數(shù)值水平的符合性較好，且PMA-qPCR檢測人工染菌樣品的最低濃度為103CFU/mL。

綜上所述，應用PMA-qPCR可對肉類中活的沙門菌進行定量檢測，避免了傳統(tǒng)檢測技術中假陽性和漏檢的情況，實現(xiàn)真正意義上的定量檢測，且操作簡便、快速。通過對樣品中活菌的準確估量可獲得食品中沙門菌污染的實際數(shù)據(jù)，大大提高我國食源性致病菌監(jiān)測和預警的能力，在食源性病原菌檢測領域具有巨大的應用前景。

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(本文編輯：范基農)

收稿日期：(2015-02-28)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0500-07R378.2

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.021

通訊作者：王文靜，聯(lián)系電話：021-62758710-1336。

作者簡介：於穎，女，1983年生，碩士，主管技師，主要從事食品微生物與分子生物學檢測，現(xiàn)工作單位為上海市疾病預防控制中心。

基金項目：上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人計劃(新百人計劃)資助項目(XBR2011051)