尿兒茶酚胺LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

彭穎斐，　吳　炯，　郭　瑋，　陳方俊，　秦嘉倩，　徐　雯，　潘柏申

尿兒茶酚胺LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

彭穎斐，吳炯，郭瑋，陳方俊，秦嘉倩，徐雯，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

摘要：目的建立尿液兒茶酚胺[包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)]的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)方法。方法以E-d3、NE-d6和DA-d4鹽酸鹽為內(nèi)標(biāo)，采用WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A1為2 ‰甲酸水溶液，流動(dòng)相B1為甲醇(純度為99.9%)，流速為0.5 mL/min，按A1∶B1=95∶5等度洗脫。采用電噴霧(ESI)正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。對(duì)方法的線性、準(zhǔn)確度(回收率)、不精密度及最低檢出限等進(jìn)行性能驗(yàn)證。選取表面健康人群65名，建立E、NE和DA的參考區(qū)間。結(jié)果采用建立的LC-MS/MS檢測(cè)尿液E、NE和DA，保留時(shí)間分別為0.58、0.89和0.63 min，檢測(cè)范圍為0.50～800.00 ng/mL。E、NE和DA的加標(biāo)平均回收率分別為97.95%、97.78%和101.03%，最低檢出限分別為0.25、2.50和2.50 ng/mL。E、NE和DA的參考區(qū)間分別為5.4～25.8、 28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。結(jié)論建立的LC-MS/MS方法能同時(shí)檢測(cè)尿液中的E、NE和DA，可為嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷提供可靠的信息。

關(guān)鍵詞：腎上腺素；去甲腎上腺素；多巴胺；尿液；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Establishment of a LC-MS/MS for the determination of urinary catecholaminesPENGYingfei，WUJiong，GUOWei，CHENFangjun，QINJiaqian，XUWen，PANBaishen

.(DepartmentofClinicalLaboratory，ZhongshanHospital，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai200032，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) for the determination of urinary catecholamines， including epinephrine(E)， norepinephrine(NE) and dopamine(DA). MethodsE， NE and DA were separated by WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm column) using E-d3， NE-d6 and DA-d4 as internal standards. The mobile phase consisted of 2‰ formic acid aqueous solution (A1) and methyl alcohol (B1, purity=99.9%). The flow rate of 0.50 mL/min was applied to the chromatographic column. Flow starting was performed with A1∶B1=95∶5. Electrospray ionization (ESI) was operated in positive ion mode. The LC-MS/MS was used， with linearity， accuracy (recovery rate)， imprecision and lower limit of determination being evaluated. A total of 65 healthy subjects were enrolled, and the reference ranges for E, NE and DA were established. ResultsThe retention times of E， NE and DA were 0.58， 0.89， 0.63 min， respectively. The determination range was from 0.50 ng/mL to 800.00 ng/mL. The mean recovery ranges were 97.95%， deter mination range 97.78% and 101.03%. The lower limits of determination for E， NE and DA were 0.25， 2.50 and 2.50 ng/mL. The reference ranges were 5.4-25.8 μg/24 h for E， 28.5-73.1 μg/24 h for NE and 269.1-420.5 μg/24 h for DA. ConclusionsThe LC-MS/MS for the simultaneous determination of E, NE and DA has been established and is suitable for clinical application. It can provide reliable information for the diagnosis of phaeochromocytoma.

Key words:Epinephrine； Norepinephrine； Dopamine： Urine； Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

尿液兒茶酚胺[包括腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)]的檢測(cè)結(jié)果對(duì)于嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤這類分泌兒茶酚胺的腫瘤的診斷具有重要意義。盡管現(xiàn)在許多研究推薦檢測(cè)血液中甲氧基腎上腺素和去甲甲氧基腎上腺素，但尿液兒茶酚胺類物質(zhì)的檢測(cè)仍然應(yīng)用普遍。由于兒茶酚胺類物質(zhì)都是微量存在的(一般為ng/mL級(jí))，且極易受到樣本氧化的干擾，因此對(duì)兒茶酚胺類物質(zhì)的精確定量就需要一個(gè)靈敏度和特異性都很好的方法。目前兒茶酚胺類物質(zhì)多用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)電化學(xué)法檢測(cè)，但存在標(biāo)本前處理時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、存在共洗脫復(fù)合物干擾等問(wèn)題[1-3]。

隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)走進(jìn)了臨床化學(xué)的檢測(cè)領(lǐng)域，它具有檢測(cè)時(shí)間短、樣本用量小、靈敏度和特異性均高的優(yōu)點(diǎn)。我們旨在建立檢測(cè)尿液E、NE和DA的LC-MS/MS方法，以替代現(xiàn)有的HPLC方法，并對(duì)自建的LC-MS/MS的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

材料和方法

一、材料

1. 儀器Waters?XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC?LC-MS/MS檢測(cè)系統(tǒng)。WATER SACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫30℃。Labconco 低溫真空離心濃縮儀。

2. 試劑標(biāo)準(zhǔn)品E鹽酸鹽、NE鹽酸鹽和DA鹽酸鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；內(nèi)標(biāo)品E-d3、NE-d6和DA-d4鹽酸鹽購(gòu)自美國(guó)Medicalisotopes公司；甲醇購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸購(gòu)自美國(guó)Roe Scientific公司。試驗(yàn)用水由Milli Q純水儀制備。所有試驗(yàn)用化學(xué)品和溶劑均為色譜級(jí)。

3. 耗材Waters Oasis弱陽(yáng)離子交換96孔固相抽提(solid-phase extraction， SPE)板和提取物收集板。

4. 對(duì)象選取2013年9月到2014年7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院表面健康人群65名，男32名，女33名，年齡25～63歲。

二、方法

1. 工作液制備和質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)品E鹽酸鹽、NE鹽酸鹽和DA鹽酸鹽的工作液采用0.1 mol/L鹽酸溶液配制，濃度范圍為0.2～800.0 ng/mL，-20℃儲(chǔ)存?？瞻啄蛞簽槌Ｒ?guī)尿液在堿性條件下100℃煮沸，再調(diào)節(jié)pH值至4.0。生化尿液質(zhì)控品購(gòu)自伯樂(lè)公司。

2. 樣本收集收集24 h尿液，防腐劑為6 mmol/L鹽酸，-20℃凍存。

3. 樣本前處理分別將尿液、標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)品取出平衡至室溫。(1)患者樣本：取患者尿液480 μL，加入內(nèi)標(biāo)20 μL，混勻，10 000×g離心1 min；(2)標(biāo)準(zhǔn)品：取空白尿液460 μL，加入標(biāo)準(zhǔn)品20 μL，再加入內(nèi)標(biāo)20 μL，混勻，10 000×g離心1 min。尿液樣本和標(biāo)準(zhǔn)品使用Waters Oasis弱陽(yáng)離子交換96孔SPE板進(jìn)行抽提和萃取。每孔預(yù)先使用甲醇(純度99.9%)和水各200 μL進(jìn)行潤(rùn)洗，之后加入混合有內(nèi)標(biāo)的500 μL樣本(尿液或標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行抽提和萃取，之后加入水和甲醇(純度99.9%)各200 μL，分別將親水、親有機(jī)相以及不同極性的雜質(zhì)洗脫，最后使用2次50 μL 2%甲酸乙腈溶液進(jìn)行洗脫，將目標(biāo)分析物以及同位素內(nèi)標(biāo)洗脫入樣本收集管。將收集的樣本放入低溫真空離心濃縮儀凍干，檢測(cè)時(shí)用100 μL水復(fù)融。

4. 色譜條件流動(dòng)相A1為2 ‰甲酸水溶液，流動(dòng)相B1為甲醇(純度99.9%)；流速為0.5 mL/min。按A1∶B1=95%∶5%等度洗脫。

5. 質(zhì)譜分析將萃取得到的樣品上機(jī)檢測(cè)，每次進(jìn)樣量為20 μL。離子化模式為電噴霧(electrospray ionization，ESI)正離子模式。質(zhì)譜儀設(shè)置參數(shù)見(jiàn)表2。

表1　質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)置

三、方法學(xué)驗(yàn)證

參照《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]對(duì)自建的LC-MS/MS進(jìn)行基本分析性能驗(yàn)證。

1. 不精密度和準(zhǔn)確度分析所用的低濃度(E：10.1～20.3 ng/mL；NE：33.0～55.0 ng/mL；DA：48.2～81.9 ng/mL)和高濃度(E：65.9～101.0 ng/mL；NE：161.0～247.0 ng/mL；DA：394.0～654.0 ng/mL)質(zhì)控品為伯樂(lè)尿液生化質(zhì)控品。(1)批內(nèi)不精密度：批內(nèi)不精密度和準(zhǔn)確度需要通過(guò)對(duì)質(zhì)控樣品重復(fù)5次分析后方可評(píng)估，不精密度可由變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)評(píng)價(jià)，可通過(guò)檢測(cè)出的濃度數(shù)值計(jì)算得到，不精密度(%)=標(biāo)準(zhǔn)偏差÷平均檢測(cè)濃度×100。準(zhǔn)確度是基于計(jì)算平均測(cè)定濃度和標(biāo)示濃度的百分比偏差而評(píng)價(jià)的。偏差(%)=(平均檢測(cè)濃度-標(biāo)示濃度)÷標(biāo)示濃度×100。偏差必須落在±15% (檢測(cè)下限為±20%)之內(nèi)，不精密度必須≤15%(定量下限≤20%)方能達(dá)到檢測(cè)要求。(2)批間不精密度：批間不精密度和準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)需要連續(xù)3 d對(duì)質(zhì)控樣品重復(fù)5次分析，得到3條獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各濃度水平的質(zhì)控品與批內(nèi)不精密度的設(shè)定相同。偏差必須落在±15% (檢測(cè)下限為±20%)之內(nèi)，不精密度必須≤15%(定量下限≤20%)方能達(dá)到檢測(cè)要求。

2. 定量下限定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)是指由特定的分析步驟能夠精確且準(zhǔn)確檢測(cè)出的最低濃度。定量下限的有效偏差為±20%以內(nèi)，且CV需≤20%。

3. 相對(duì)回收率在同一尿液標(biāo)本中分別加入濃度為2、40和200 ng/mL的E、NE、DA。按樣本前處理方法操作，測(cè)定加入前、后尿液E、NE、DA濃度。相對(duì)回收率為E、NE、DA增加濃度與加入濃度的比值。提取回收率在80%～120%之間判斷為可接受。

4. 線性評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立選取7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度分裝6份，連續(xù)檢測(cè)6 d。

四、參考區(qū)間建立

檢測(cè)65名表面健康人群的尿液E、NE和DA濃度，取雙側(cè)95百分位數(shù)值作為參考區(qū)間上、下限，建立參考區(qū)間。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、分離條件優(yōu)化

1. 流動(dòng)相中有機(jī)溶劑對(duì)保留時(shí)間的影響按照流動(dòng)相A1和B1的不同比例，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間隨著甲醇比例的增加而縮短，但變化程序逐漸減小，當(dāng)甲醇比例為95%時(shí)，保留時(shí)間較短且彼此能較好分離。故確定流動(dòng)相為2‰甲酸水溶液∶甲醇=95%∶5%。

2. 柱溫對(duì)保留時(shí)間的影響將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在不同柱溫下分析，隨著柱溫的增加，保留時(shí)間相應(yīng)縮短，當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，E、NE、DA能較好的分離，且分析時(shí)間適中。故確定柱溫為30℃。

二、檢測(cè)尿液E、NE和DA的LC-MS/MS的建立及性能驗(yàn)證

1. LC-MS/MS檢測(cè)E、NE和DA的色譜圖E(m/z 184.0→166.0)及其內(nèi)標(biāo)物E-d3(m/z 187.0→169.0)的保留時(shí)間均為0.63 min；NE(m/z 152.0→107.0)及其內(nèi)標(biāo)物NE-d6(m/z 158.0→111.0)的保留時(shí)間分別為0.58和0.57 min；DA(m/z 154.0→137.0)及其內(nèi)標(biāo)物DA-d4(m/z 158.0→141.0)的保留時(shí)間分別為0.89和0.88 min。見(jiàn)圖1。

2. 線性評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立LC-MS/MS檢測(cè)E、NE、DA在0.50～800.00 ng/mL內(nèi)均呈線性，線性評(píng)估相關(guān)系數(shù)(r2)均>0.99，見(jiàn)表3。

3. 準(zhǔn)確度E的回收率為93.1%～102.1%，平均為97.95%；NE的回收率為92.2%～104.4%，平均為97.78%；DA的回收率為96.2%～105.4%，平均為101.03%。均符合回收率80%～120%的標(biāo)準(zhǔn)。

注：(a)E(m/z 184.0→166.0)；(b)E-d3(m/z 187.0→169.0)；保留時(shí)間均為0.63 min

圖1E及其內(nèi)標(biāo)E-d3的色譜圖

注：(a)NE(m/z 152.0→107.0)，保留時(shí)間為0.58 min；(b)NE-d6(m/z 158.0→111.0)，保留時(shí)間為0.57 min

圖2NE及其內(nèi)標(biāo)NE-d6的色譜圖

注：(a)DA(m/z 154.0→137.0)，保留時(shí)間為0.89 min；(b)DA-d4(m/z 158.0→141.0)，保留時(shí)間為0.88 min

圖3DA及其內(nèi)標(biāo)DA-d4的色譜圖

4. 不精密度LC-MS/MS檢測(cè)E、NE和DA不精密度(CV)均<15%，滿足要求。見(jiàn)表3。

5. LLOQLC-MS/MS檢測(cè)E、NE和DA的LLOQ[信噪比(signal-noise ratio, S/N)=10∶1]分別為0.25、2.50和2.50 ng/mL。CV分別為13.24%、10.14%、9.26%，偏差分別為18.5%、15.4%、16.5%。

表2　LC-MS/MS檢測(cè)E、NE和DA的線性評(píng)估(ng/mL)

表3　LC-MS/MS檢測(cè)E、NE和DA的不精密度

三、參考區(qū)間的建立

采用LC-MS/MS檢測(cè)65名健康體檢者尿液E、NE和DA。由于3項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果均呈正態(tài)分布，因此取雙側(cè)95百分位數(shù)值作為參考區(qū)間上、下限。E的參考區(qū)間為5.4～25.8 μg/24 h、NE的參考區(qū)間為28.5～73.1 μg/24 h，DA的參考區(qū)間為269.1～420.5 μg/24 h。

討論

尿液兒茶酚胺檢測(cè)是診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的一項(xiàng)重要生化指標(biāo)。在過(guò)去的許多年里，許多報(bào)道證明HPLC和免疫分析等方法檢測(cè)尿兒茶酚胺代謝產(chǎn)物能夠提高嗜鉻細(xì)胞瘤診斷的靈敏度和特異性。目前常用的檢測(cè)方法有熒光法、放射酶學(xué)測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法和HPLC。前3種方法因試劑價(jià)格昂貴、步驟繁瑣，因而增加了檢驗(yàn)難度，且準(zhǔn)確性較差；HPLC雖然測(cè)定較為準(zhǔn)確，但仍存在標(biāo)本流動(dòng)相配置復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，最低定量下限較高等問(wèn)題[1，5]。

BICKER等[5]對(duì)液相色譜法檢測(cè)各種類型標(biāo)本中兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。采用LC-MS/MS檢測(cè)尿兒茶酚胺與HPLC進(jìn)行比較，可以得出以下優(yōu)點(diǎn)：(1)檢測(cè)時(shí)間縮短：HPLC單個(gè)樣本的檢測(cè)時(shí)間一般為10 min左右[6]，而LC-MS/MS 在1 min內(nèi)即可完成檢測(cè)；(2)所需樣本量少：HPLC檢測(cè)所需樣本量一般為1 mL左右，甚至更多，而LC-MS/MS僅需460 μL即可完成檢測(cè)；(3)靈敏度高：HPLC檢測(cè)E的最低檢出限一般為1 ng/mL以上[5]，而LC-MS/MS由于使用配對(duì)離子對(duì)檢測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)本身，所以檢測(cè)的敏感性和特異性有所提高，本研究自建方法的最低檢出限為0.25 ng/mL，較HPLC有了很大的提高。

本研究還初步建立了健康人尿液E、NE和DA的參考區(qū)間，結(jié)果分別為5.4～25.8、28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。DE JONG等[1]使用了與本研究相同的儀器和檢測(cè)模式，得出的參考區(qū)間為E：15～104 nmol/24 h(2.75～19.00 μg/24 h)；NE：139～592 nmol/24 h(23.5～100.0 μg/24 h)；DA：702～2 803 nmol/24 h(107.4～428.8 μg/24 h)。該結(jié)果與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，本研究建立了可靠的檢測(cè)尿液兒茶酚胺的LC-MS/MS方法，能同時(shí)檢測(cè)尿液中的E、NE和DA濃度，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，操作簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短，樣本用量少，靈敏度和特異性較高，適用于臨床嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤這類分泌兒茶酚胺腫瘤的輔助診斷。

參考文獻(xiàn)

[1]DE JONG WH，DE VRIES EG，WOLFFENBUTTEL BH，et al. Automated mass spectrometric analysis of urinary free catecholamines using on-line solid phase extraction[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878(19)：1506-1512.

[2]PEITZSCH M，PELZEL D，GL?CKNER S，et al. Simultaneous liquid chromatography tandem mass spectrometric determination of urinary free metanephrines and catecholamines，with comparisons of free and deconjugated metabolites[J]. Clin Chim Acta，2013，418：50-58.

[3]CLARK ZD，F(xiàn)RANK EL. Urinary metanephrines by liquid chromatography tandem mass spectrometry:using multiple quantification methods to minimize interferences in a high throughput method[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879(31)：3673-3680.

[4]化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].GCL1-2，2005.

[5]BICKER J，F(xiàn)ORTUNA A，ALVES G，et al. Liquid chromatographic methods for the quantification of catecholamines and their metabolites in several biological samples-a review[J]. Anal Chim Acta，2013，768:12-34.

[6]KUMAR A，HART JP，MCCALLEY DV. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection[J]. J Chromatogr A，2011，1218(25)：3854-3861.

(本文編輯：龔曉霖)

收稿日期：(2015-01-31)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0433-04R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.006

通訊作者：潘柏申，聯(lián)系電話：021-64041990-2376。

作者簡(jiǎn)介：彭穎斐，女，1985年生，學(xué)士，技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAI37B01)；國(guó)家臨床重點(diǎn)檢驗(yàn)?？平ㄔO(shè)資助項(xiàng)目