腎臟衰老機制的探討

李典耕，孫雪峰，陳香美

（解放軍總醫(yī)院腎臟病科，解放軍腎臟病研究所，腎臟疾病國家重點實驗室，國家慢性腎病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100853）

隨著科學技術及醫(yī)學的進步和發(fā)展，人口老齡化已成為當今社會面臨的重要問題，研究發(fā)現(xiàn)衰老與心血管疾病、腫瘤以及慢性腎臟病的發(fā)生率升高密切相關，腎臟衰老表型包括腎臟實質減少、腎臟血管阻力增加、腎血流量降低及濾過分數增加，這些改變通常于50～60歲時開始發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)有多種因素參與腎臟衰老，本文旨在回顧既往發(fā)表文獻，總結腎臟衰老的可能分子機制。

1 腎臟衰老表型

腎臟衰老表型包括特征性功能改變如腎血管阻力增加、腎血漿流量降低及腎小球濾過分數增加。形態(tài)學變化包括皮質質量減少表現(xiàn)，病理改變如腎小管萎縮、間質纖維化和腎小球硬化[1]。臨床上發(fā)現(xiàn)腎臟衰老與急性腎損傷易感性增加相關，急性腎損傷病程較嚴重、腎臟治愈較低[2]。急性腎損傷在衰老腎臟的高發(fā)生率可部分歸因于高血壓、糖尿病和其他系統(tǒng)性疾病所致的合并癥高負荷及先前已存在的腎損傷[3]。然而，越來越多的證據表明外在因素與腎臟本身隨年齡變化而發(fā)生的改變一致[4?6]。

2 體細胞衰老

在導致腎臟衰老的生物機制中，體細胞衰老（somatic cellular senescence，SCS）被認為是關鍵因素[4,7?9]。SCS是指細胞仍然存活并有代謝活性，但不能再重新進入細胞周期。細胞衰老一詞最早是50多年前由Hayfick提出，他發(fā)現(xiàn)人體細胞在體外培養(yǎng)時只能進行幾次有限的細胞分裂，2009年發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與端粒縮短有關[10]。端粒是帽狀核蛋白組成的重復DNA序列特異性蛋白，位于真核染色體末端。當端粒受損或縮短時端粒的保護功能失效同時觸發(fā)細胞應答激活DNA修復機制。這一過程將使磷脂酰肌醇3?激酶樣激酶激活，這類激酶將活化下游的阻止DNA復制和其他被p53磷酸化的細胞增殖的因素[7]。活化的p53可以通過上調凋亡基因或細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑視網膜母細胞瘤蛋白低磷酸化（p21CIP1/WAF1）啟動細胞凋亡或衰老。在這種低磷酸化過程中，視網膜母瘤蛋白抑制細胞周期進程。若非如此，一些應激因素（如氧化應激）可以加速端粒損傷或直接破壞DNA，從而通過共濟失調?毛細血管擴張突變基因（ataxia-telangiectasia，ATM）/Rad-3相關蛋白（ATM and Rad-3 related，ATR）和p53誘導DNA損傷。還有一說法認為p53可以以應激依賴性方式被p19ARF感應或人類p14ARF激活，然后與小鼠雙微體2（mouse double minute 2，MDM2）或人類雙微體（human double minute 2，HDM2）結合從而抑制p53泛素化及降解。

SCS不會只通過端粒損傷或p53途徑發(fā)生，小鼠胚胎成纖維細胞雖然表達端粒酶，但經過15～30代增殖即使發(fā)生生長停滯仍沒有端粒損傷，這種被不同細胞應激（如氧化應激、代謝應激、癌基因）導致的不依賴端粒的生長停滯也被稱為“刺激和應激引導的衰老樣”停滯（stress-induced senescence-like arrest，STASIS）。STASIS通常與p16NK4表達水平升高相關，p16INK4a是細胞周期依賴性激酶4、6的抑制劑，而細胞周期依賴性激酶4、6可以上調Rb（32-34）。SCS體外逆轉僅被證明與p16INK4a低表達相關，一旦p16INK4a表達升高，將不再發(fā)生SCS逆轉。衰老狀態(tài)的不可逆轉可能是由染色質結構的改變引起的，且p16INK4a也參與改變染色質結構[11]。

培養(yǎng)衰老細胞的特點是它們的共同表型，且不依賴于細胞是否發(fā)生端粒依賴性或端粒非依賴性衰老。衰老細胞表現(xiàn)典型的形態(tài)改變即外觀肥大、扁平，發(fā)生形態(tài)學變化的同時還有衰老相關β半乳糖苷酶（SA-β-GAL）表達升高相關、Ph6和脂褐素顆粒的沉積[12]。

根據當前的進化理論，機體衰老可能是由于多個基因激活引起的，這些基因是從祖先環(huán)境進化而來的，然而這種未受保護的進化環(huán)境抑制大多數人有長的壽命，晚年已成為規(guī)律。因此，可能對現(xiàn)代人類生殖后期衰老不利基因的表達在進化過程中是無關緊要的，相反，那些在生命早期起有益作用的基因得到進化選擇。根據拮抗多效性的衰老理論，一些基因表現(xiàn)時間順序拮抗，雖然這些基因在生命早期起有益作用，但在晚年可能有危害作用。誘導SCS的基因可以解釋為經典的多效權衡基因，在生命早期這些基因通過抑制有惡性轉化風險的細胞增殖而成為腫瘤進展的內在屏障，然而，在生命后期這些基因通過使有活性的但不能促進器官穩(wěn)定和修復的細胞聚積從而促進衰老。因此，SCS可對早期脊椎動物致癌應激起保護作用從而發(fā)揮生存優(yōu)勢，而衰老的SCS相關疾病即為這種生命早期的保護付出的代價。近期有研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥參與影響集體衰老、壽命，單免疫球蛋白白介素1相關受體（SIGIRR）抑制TLR4/NF-x03BA：B通路誘導免疫應答[13]。

3 SCS在腎臟衰老表型

雖然哺乳動物腎臟在衰老過程中發(fā)現(xiàn)有衰老細胞的積聚，但將這種現(xiàn)象簡單地與衰老相關的腎臟表型聯(lián)系在一起仍很牽強。通常情況下小鼠和人腎臟中細胞增殖率是非常低的[14]，雖然增殖率低，但人以及小鼠、大鼠腎臟中細胞周期調控因子p16INK4a的表達隨著年齡的增長而增加，p16INK4a主要表達在腎小管上皮細胞中。與嚙齒動物相反，人類腎臟表現(xiàn)為端粒隨著年齡越長而縮短，但這些衰老細胞或將要衰老的細胞對腎臟功能和結構的影響很小。發(fā)生急性腎損傷時，腎小管上皮細胞脫落，存活的細胞通過快速進入細胞周期以恢復小管結構的完整性[14]。然而，當衰老腎臟發(fā)生急性腎損傷時，由于衰老腎臟有相當數量的衰老細胞，很難啟動充足的細胞更新，從而導致細胞更新應答不充分。這一觀點在急性腎損傷的動物實驗中，通過老年野生小鼠及端粒酶缺陷小鼠表現(xiàn)腎臟衰老加快表型的數據得到進一步的證實[15,16]。在人類腎臟中，Ki-67表達與p61INK4a表達相反，說明細胞增殖與SCS呈負相關，腎臟p16INK4a的積聚不僅見于正常衰老腎臟，也可見于多種形式的腎損傷中[9,16]，如移植后應激可誘導衰老的發(fā)生，因此當移植腎出現(xiàn)p16INK4a高表達時，可能提示移植腎惡化（如腎小管萎縮、間質纖維化），移植腎出現(xiàn)SCS高度聚積可能提示惡化加劇[17]。這種通過SCS介導的有限再生能力對衰老器官尤為重要，因為它不僅限制急性損傷恢復，還限制對持續(xù)應激的耐受。來自老年供體的腎臟不僅在移植后衰老加快，并且這種衰老是附加在移植前已經發(fā)生的一定程度的衰老過程。在兩個獨立研究中發(fā)現(xiàn)移植時SCS可以預測移植后1年的移植腎臟存活情況[18,19]。在這些研究中，移植腎臟活檢p16INK4a的表達可以作為腎臟生理壽命和移植預后的生物標志物。但是，臨床更需要能監(jiān)測SCS發(fā)展以及指導臨床治療方案的無創(chuàng)標志物。隨著時間的延長，SCS與移植腎臟惡化成強烈正相關，并且衰老的細胞不僅不會消失，而且會不斷積累。然而一些證據表明在一些條件下衰老細胞可以在體內逆轉，研究發(fā)現(xiàn)細胞衰老通過先天免疫系統(tǒng)而誘導清除機制[20]，由于免疫抑制劑治療可能增加衰老細胞的積聚，因此移植治療應注意這一過程。除了這一間接作用，免疫抑制劑也可能直接促進細胞衰老的進展。在細胞培養(yǎng)時，環(huán)孢素A可誘導腎小管上皮細胞衰老[21]，另外一項腎臟移植活檢研究發(fā)現(xiàn)p16INK4a陽性細胞的比率在接受環(huán)孢素A治療的患者中較高[22]，這些研究結果表明選擇合適的免疫抑制劑可能有助于避免腎移植SCS的進展。

4 非上皮細胞中的SCS

目前，我們認為SCS通過降低腎小管上皮細胞功能和修復能力而在腎臟衰老過程中起有害作用，然而一些證據表明可能存在細胞類型依賴性機制。當腎小管上皮細胞發(fā)生不可逆轉的生長停滯時，將影響小管結構的完整性，然而當間質成纖維細胞發(fā)生生長停滯時，情況可能是不同的。由于活化的間質成纖維細胞可生成促纖維化因子和細胞外基質蛋白，從而被認為是介導腎臟纖維化的關鍵因素[23]。研究還發(fā)現(xiàn)衰老的成纖維細胞產生基質金屬酶增加，因此誘導膠原降低從而抑制纖維化的進展[24]。在肝臟的研究中發(fā)現(xiàn)，星狀細胞的SCS可通過減少細胞外基質成分分泌、促進蛋白酶分泌抑制肝臟纖維化[20]，另外Wolstein等[25]發(fā)現(xiàn)在單側輸尿管閉塞（unilateral ureteral occlusion，UUO）模型中，如果通過使p16INK4a拮抗衰老，間質細胞增殖增加、炎癥和細胞外基質沉積增加，從而推測SCS可能通過p16INK4a減少炎癥和細胞增殖從而抑制纖維化進展[25]。從以上研究結果可見SCS相關的對腎臟衰老的生物效應主要取決于細胞類型相關的不同的分子途徑。

線粒體是產生作為氧化磷酸化副產物活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要細胞器，根據衰老線粒體蛋白理論，由于脂質和DNA直接暴露于ROS，從而成為衰老過程中氧化性損傷的主要靶目標。核DNA可以受組蛋白保護，然而端粒和各種修復酶mtDNA對于ROS誘導的應激沒有任何保護機制或明顯的修復系統(tǒng)。因此，相對于核DNA，氧化應激主要影響mtDNA。如果mtDNA在ROS相關應激下發(fā)生突變，線粒體功能障礙將進一步增加ROS水平，從而造成惡性循環(huán)[26]。由于腎臟細胞消耗大量的線粒體產生的能量，因此線粒體衰老將可能影響腎臟穩(wěn)態(tài)和腎臟衰老[6]。

5 PGC1 抑制關聯(lián)端粒功能降低對線粒體的影響

Dpinho等研究發(fā)現(xiàn)端粒功能障礙與線粒體衰老之間存在直接的分子聯(lián)系[27]，端粒功能障礙誘發(fā)的p53可直接抑制過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（α subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1α）和過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1β（β subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1β）的表達[28]，這兩個基因是轉錄共激活因子小家族成員，是調控線粒體生物合成和功能的主要調節(jié)因子[28]。通過活化p53抑制PGC網可導致衰老組織常見的改變，如線粒體生物功能受損、呼吸功能降低以及ROS生成增加[27]。因此，推測端粒因衰老發(fā)生的耗損是通過p53誘導轉錄子變化導致線粒體衰老，這一關聯(lián)可解釋細胞衰老是怎樣影響器官（如腎臟）的能量供應。如果端粒功能障礙損害細胞的能量供應，那么就容易發(fā)生腎小管變性及萎縮。因此，需要進一步研究端粒?線粒體同在腎臟生理、衰老和疾病過程中的作用。去乙酰化酶1（sirtuin type 1，SIRT1）作為依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的組蛋白脫乙酰可以穩(wěn)定PGC-1α，SIRT1由于其抗衰老作用一直是衰老研究領域的一個重點，通過熱量限制可以干預哺乳動物衰老，在這一過程中SIRT1在腎臟表達增加。He等發(fā)現(xiàn)藥物SIRT1激動劑可以改善氧化應激下的細胞存活、減輕UUO腎臟損傷模型的腎臟病理改變，這些表明SIRT1在腎臟衰老過程中充當關鍵的細胞保護因子，這與SIRT1穩(wěn)定PGC網、維持充足的線粒體功能是一致的。

6 線粒體功能和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)

腎素?血管緊張素?醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）是血壓、血流穩(wěn)態(tài)和心血管生理學的重要調節(jié)系統(tǒng)，RAAS參與心血管疾病的發(fā)生，RAAS阻滯劑可以用于治療高血壓、腎臟和心血管疾病。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAAS主要效應分子，可以刺激醛固酮釋放腎上腺素并通過其血管收縮和儲鈉作用增加血壓。在細胞水平，AngⅡ可引起增殖、促炎、纖維化活化等病理變化，AngⅡ與胞漿和線粒體ROS生成相關，這就可以DNA損傷通路解釋細胞衰老與器官衰老之間的聯(lián)系[6,29]。兩種細胞表面受體即1型（AT1R）和2型（AT2R）可介導AngⅡ反應，另外在很多器官包括腎臟上皮細胞中發(fā)現(xiàn)AngⅡ參與細胞外通路和細胞外功能過程[30]，細胞外AngⅡ不僅存在于細胞核中，也存在于線粒體中。Abadir等[31]早前已發(fā)現(xiàn)線粒體血管緊張素系統(tǒng)，研究證實AngⅡ和AT2R位于線粒體內膜，且活化的受體可通過增加線粒體一氧化氮的生成抑制呼吸鏈功能[31]。雖然還需要對這些結果進行進一步的研究，但這些結果均表明，AngⅡ活化免受呼吸過度和ROS過度產生導致線粒體AT2R起到失衡作用。Abadir等發(fā)現(xiàn)了與年齡相關的閾值開關，即老年小鼠出現(xiàn)線粒體AT2R表達降低或AT2R表達增加[31]，這一閾值開關可被長期藥物AT1R阻斷劑（氯沙坦）逆轉。AT1R阻斷劑可以顯著增加心臟組織一氧化氧的生成，同時降低過氧化氫的形成。RAAS抑制劑可以保護腎臟組織線粒體由于ATP產生引起的與年齡相關的功能下降，同時降低線粒體氣體劑釋放的增加。另外，AT1R基因缺失可以通過改善腎小管上皮細胞年齡相關的線粒體全功能障礙而使這種小鼠的壽命延長。

SCS在腎臟衰老和腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，無論是臨床研究和基礎實驗研究均發(fā)現(xiàn)SCS對實體器官移植的影響，抑制SCS進展的治療可能改善腎移植的長期預后而成為新的治療手段。

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