高郵鴨群體 MSTN、MyoD1和 MyoG基因外顯子中SNP位點(diǎn)的分析

高郵鴨群體MSTN、MyoD1和MyoG基因外顯子中SNP位點(diǎn)的分析

劉宏祥，徐文娟，宋衛(wèi)濤，朱文奇，胡艷，姬改革，李慧芳

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州225125)

摘要：MSTN、MyoD1和MyoG基因與禽類骨骼肌的生長發(fā)育密切相關(guān)。本試驗(yàn)以高郵鴨為素材，對MSTN、MyoD1和MyoG 3個基因的外顯子單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，并對這些位點(diǎn)對蛋白質(zhì)的影響及群體遺傳信息進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，MSTN、MyoD1和MyoG 3個基因的外顯子分別有9個、4個和7個SNP位點(diǎn)，其中具有中度多態(tài)的位點(diǎn)分別為8個、1個和5個，有義突變各1個，這些有義突變均改變了相應(yīng)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)以及二級結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：MSTN；MyoD1；MyoG；外顯子；單核苷酸多態(tài)性；鴨

doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2015.03.023

收稿日期：2014-12-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172194)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2011329、BE2012460)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)品種創(chuàng)新項(xiàng)目[CX(11)1030]

作者簡介：劉宏祥(1985-)，男，江蘇揚(yáng)州人，碩士，主要從事家禽遺傳育種與資源保護(hù)研究。(Tel)13665203762;(E-mail)liuhongxiangzai@163.com

中圖分類號：S834`+.89

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440(2015)03-0604-09

Abstract：There are strong relations between MSTN, MyoD1, MyoG genes and development of skeletal muscle. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the exons of MSTN, MyoD1 and MyoG genes of Gaoyou duck were detected, and their influences on proteins and population genetics information were studied. There were nine, four SNPs and seven SNPs in the exons of MSTN, MyoD1 and MyoG genes, respectively, among which, eight, one and five SNPs were moderate polymorphic. One sense mutation detected in each gene changed the protein physico-chemical characteristics and second structure.

Analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in exons ofMSTN, MyoD1 andMyoGgenes of Gaoyou duck

LIU Hong-xiang,XU Wen-juan,SONG Wei-tao,ZHU Wen-qi,HU Yan,JI Gai-ge,LI Hui-fang

(JiangsuInstituteofPoultryScience,Yangzhou225125,China)

Key words：MSTN;MyoD1;MyoG;exon;single nucleotide polymorphism (SNP);duck

動物機(jī)體的生長是一個復(fù)雜的生理過程，對肌肉生長具有調(diào)節(jié)作用的因子很多，其中重要的有MRFs(Muscle regulation factors)家族的MyoD1基因、MyoG基因，它們對肌肉生長具有正向調(diào)節(jié)功能；而TGFβ家族中的MSTN基因?qū)∪馍L具有負(fù)調(diào)控作用，其功能的缺失在哺乳動物中能夠引起肌肉的顯著增大[2-4]。

具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因在DNA水平上的堿基序列變化將傳遞給蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)序列的改變將影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及高級結(jié)構(gòu)，甚至改變蛋白質(zhì)的功能?；蚪M水平上的單個核苷酸的變異(SNP)在染色體上數(shù)量多、分布廣，而且能夠穩(wěn)定遺傳。因此在動物遺傳育種中，對功能基因，尤其直接編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分的SNP研究具有重要意義。

已有多個研究報(bào)道了哺乳動物(比如牛[3, 5]、小鼠、綿羊[7-8]、狗)MSTN基因外顯子的錯義突變導(dǎo)致了機(jī)體肌肉的顯著增長。張跟喜等[10]在2011年對邊雞的MSTN基因外顯子1進(jìn)行了SNP篩查，發(fā)現(xiàn)一個對邊雞生長有顯著效應(yīng)的SNP位點(diǎn)。

高郵鴨屬于肉蛋兼用型地方品種，經(jīng)過多年選育，目前高郵鴨群體性能已基本穩(wěn)定。本試驗(yàn)運(yùn)用單重PCR方法對高郵鴨群體的MSTN、MyoD1和MyoG3個基因的外顯子分別進(jìn)行了SNP篩查，并分析篩查到有義突變導(dǎo)致氨基酸變化以及對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，為高郵鴨群體后期的分群以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)動物

高郵鴨試驗(yàn)群體來源于江蘇省高郵鴨集團(tuán)，性成熟時從群體中隨機(jī)選擇30個體質(zhì)量差異較小的個體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2　主要儀器和試劑

主要儀器有：PCR儀(型號：Gene Amp PCR，廠家：Norwalk,CT.06859 USA)、電泳儀(型號：JY600+，廠家：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、全自動紫外與可見分析裝置(型號：FR-200A，廠家：上海復(fù)日科技有限公司)、生物電泳圖像分析系統(tǒng)(廠家：上海復(fù)日科技有限公司)。

主要試劑有：PCR引物(由上海瀚宇生物工程有限公司合成，PAGE級純化)、PCR反應(yīng)試劑(上海有漁生物工程有限公司提供)。

1.3　DNA的提取

對30個高郵鴨個體翅靜脈采血，用酚-氯仿法抽提DNA并溶于超純水中。將DNA原液 1∶100稀釋并進(jìn)行分光光度計(jì)檢測，OD值為 1.85～1.94。

1.4　引物設(shè)計(jì)

分別在MSTN基因3個外顯子、MyoD1基因4個外顯子、MyoG基因5個外顯子區(qū)域附近設(shè)計(jì)合適的引物，其中MSTN、MyoD1和MyoG基因分別設(shè)計(jì)了4、4和3對引物。具體信息見表 1。

表1針對MSTN、MyoD1和MyoG基因外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)的引物

Table 1The primers for the exons ofMSTN, MyoD1 andMyoGgenes

基因外顯子引物名稱 引物序列(5'→3')退火溫度(℃)產(chǎn)物長度(bp)MSTN外顯子1P1-1F:CCTTGGAATATATAAGGTACAC-CAG56600R:CCTGAGCAGGAGTTGTGTG外顯子2P1-2F:TTTGCCGTAGAGCGTAAAGC56691R:GCAAAGAGCGAAAGAATTGG外顯子3P1-3F:TGATTTGATAGGTTTGTGT-CAGAGA56816R:TGTTGAAACCTGCGTATGGAP1-4F:TGTCAACCAGTGGGAAAAGA56828R:AACATCATTCTTTTCTTGTGAT-GAAMyoD1外顯子1P2-1F:CATCGTATTCCCCATTTGACA56385R:AACAGTGACTCCTCCCTAACCA外顯子2P2-2F:GGGTCTGTAGGTTGGGAATG59838R:GAGGACGTACGCCAGCAG外顯子3P2-3F:GGAGGGGAGGCAAGTTAAGA56474R:GCTGTAACGCATCCCCATAC外顯子4P2-4F:TGTCATAATTGGCATCCTTCA56922R:GCACAACAAACCAAGCAACAMyoG外顯子1P3-1F:GATGCGAGGAAGCAGCTTAG62973R:GGGAGGGGCACACTTTTATT外顯子2、3P3-2F:ATGGCAGTGCCCAGCTAC56454R:AGCTGAGCTGCCAAACCTC外顯子4、5P3-3F:TGGGCATTGTGCTGCTGTGA591084R:CGCCGGAGGGATAAATAGGA

1.5　PCR產(chǎn)物擴(kuò)增與測序

PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中包括：1.0 μl模板(50 ng)、2.0 μl Buffer緩沖液(1×)、0.6 μl鎂離子(2 mmol/L)、2.0 μl dNTP(2 mmol/L)、0.2 μlTaq酶(1 U)、2.0 μl引物混合液(0.5 pmol/L)，余下用H2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，按照表 1中的退火溫度退火1 min 30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測擴(kuò)增效果。最后對產(chǎn)物進(jìn)行純化，并送由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司測序。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析

1.6.3Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)假設(shè)某群體的某一位點(diǎn)等位基因有A、B兩種，其等位基因頻率分別為p、q。該群體基因型有AA、AB、BB 3種，基因型頻率分別記為D、H和R。根據(jù)觀測到的基因型頻率，可以計(jì)算出等位基因頻率：

p=D+H/2,q=R+H/2

根據(jù)等位基因頻率，可以計(jì)算出理論的基因型頻率：

D′=p2，H′=2pq，R′=q2

根據(jù)樣本含量、觀測基因型頻率和理論基因型頻率，可以分別計(jì)算出觀測基因型頻數(shù)和理論基因型頻數(shù)。通過卡方檢驗(yàn)：

χ2=(D-D′)2/D′+(H-H′)2/H′+(R-R′)2/R′

計(jì)算出卡方值。如果卡方值對應(yīng)的概率大于0.05，那么可以認(rèn)為該等位基因處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

1.6.4蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析利用ExPASy網(wǎng)站中的ProtParam服務(wù)器(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)在線計(jì)算MSTN、MyoD1和MyoG蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、分子量、正負(fù)電位氨基酸數(shù)目、不穩(wěn)定系數(shù)、蛋白質(zhì)親水性及脂肪族氨基酸指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.6.5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的紐帶，也是通過一級結(jié)構(gòu)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟[11]。對MSTN、MyoD1和MyoG基因的外顯子突變情況進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)3個基因各有1個有義突變導(dǎo)致了氨基酸的變化。SSPro 4.0(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)可以使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與同源分析混合進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[12]，預(yù)測的結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，因此本試驗(yàn)使用該服務(wù)器作為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的工具。

2結(jié)果與分析

2.1　 MSTN、MyoD1和 MyoG 3個基因外顯子突變位點(diǎn)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序、對比，MSTN外顯子中發(fā)現(xiàn)9個SNP位點(diǎn)，編號為SNP1-1～SNP1-9，具體信息見表2。SNP1-1～SNP1-5位于CDS區(qū)，其中SNP1-1導(dǎo)致了甘氨酸(G)到絲氨酸(S)的變化，其余為沉默突變。SNP1-6～SNP1-9位于非CDS區(qū)。

MyoD1外顯子中共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點(diǎn)，編號為SNP2-1～SNP2-4。這4個SNP位點(diǎn)均處于CDS區(qū)，其中SNP2-1導(dǎo)致了蛋氨酸(M)向亮氨酸(L)的轉(zhuǎn)變，其他3個SNP位點(diǎn)均為沉默突變。

MyoG外顯子中共發(fā)現(xiàn)了7個SNP位點(diǎn)，編號為SNP3-1～SNP3-7。這7個SNP位點(diǎn)均處于CDS區(qū)，其中SNP3-7為有義突變，導(dǎo)致谷氨酸(E)到天冬氨酸(D)的變化，其余均為沉默突變。

2.2　 MSTN、MyoD1和 MyoG 3個基因外顯子的遺傳多樣性

對30個高郵鴨個體的MSTN、MyoD1和MyoG基因的基因型頻率以及基因頻率分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別見表3、表4和表5。

根據(jù)各個SNP位點(diǎn)的基因型分布情況，對各個位點(diǎn)進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。MSTN基因外顯子所有突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；MyoD1基因突變位點(diǎn)SNP2-2、SNP2-3和SNP2-4均不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；MyoG基因突變位點(diǎn)SNP3-2、SNP3-3和SNP3-5均不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2MSTN、MyoD1和MyoG基因突變位點(diǎn)

Table 2SNPs ofMSTN, MyoD1 andMyoGgenes

基因SNP位點(diǎn)外顯子雜合子類型氨基酸變化編碼子位置氨基酸位置優(yōu)勢堿基MSTNSNP1-1外顯子1GAGGC/AGC(G/S)126AMSTNSNP1-2外顯子1GAACG/ACA(T)343AMSTNSNP1-3外顯子1CTGAC/GAT(D)3108CMSTNSNP1-4外顯子3AGGTA/GTG(V)3327GMSTNSNP1-5外顯子3CAGGC/GGA(G)3334AMSTNSNP1-6外顯子3TC 非CDS區(qū)CTMSTNSNP1-7外顯子3GT 非CDS區(qū)GMSTNSNP1-8外顯子3AC 非CDS區(qū)AMSTNSNP1-9外顯子3AC 非CDS區(qū)CMyoD1SNP2-1外顯子1ACATG/CTG(M/L)14AMyoD1SNP2-2外顯子4GAGAG/GAA(E)3190G*MyoD1SNP2-3外顯子4TCACT/ACC(T)3207T*MyoD1SNP2-4外顯子4TCCCT/CCC(P)3247T*MyoGSNP3-1外顯子1CTCTG/TTG(L)143CMyoGSNP3-2外顯子1GCGTG/GTC(V)379G*MyoGSNP3-3外顯子1CGCGC/CGG(R)3132C*MyoGSNP3-4外顯子3CTCAC/CAT(H)3157CTMyoGSNP3-5外顯子4GAACG/ACA(T)3187G*MyoGSNP3-6外顯子5GATCG/TCA(S)3203GMyoGSNP3-7外顯子5GCGAG/GAC(E/D)3222C

氨基酸變化欄中括號前的字母表示三聯(lián)密碼子的變化情況，括號中的字母表示氨基酸的變化情況；編碼子位置欄中數(shù)字表示三聯(lián)密碼子中發(fā)生突變的堿基在密碼子中的位置，非CDS區(qū)表示該突變不在CDS區(qū)中；優(yōu)勢堿基表示在突變位點(diǎn)的2個等位堿基在群體中出現(xiàn)頻率較大的堿基；*表示該位點(diǎn)的2個堿基在群體中的分布不符合Hardy-Weinberg平衡。

表3MSTN基因SNP位點(diǎn)的群體信息

Table 3The population information about SNPs ofMSTNgene

SNP位點(diǎn)等位基因型頻率等位基因頻率SNP1-1AAAGGGAG0.63(17)0.33(9)0.04(1)0.800.20SNP1-2AAAGGGAG0.67(18)0.30(8)0.04(1)0.810.19SNP1-3CCCTTTCT0.96(26)0.04(1)0(0)0.980.02SNP1-4AAAGGGAG0.14(4)0.43(12)0.43(12)0.360.64SNP1-5AAACCCAC0.43(12)0.43(12)0.14(4)0.640.36SNP1-6CCCTTTCT0.29(8)0.43(12)0.29(8)0.500.50SNP1-7GGGTTTGT0.46(13)0.43(12)0.11(3)0.680.32SNP1-8AAACCCAC0.46(13)0.43(12)0.11(3)0.680.32SNP1-9AAACCCAC0.21(6)0.46(13)0.32(9)0.450.55

括號內(nèi)數(shù)字表示該等位基因型在檢測群體中的觀測個數(shù)。粗體表示有義突變。

表4MyoD1基因SNP位點(diǎn)的群體信息

Table 4The population information about SNPs of MyoD1 gene

SNP位點(diǎn)等位基因型頻率等位基因頻率SNP2-1AAACCCAC0.90(27)0.10(3)0(0)0.950.05SNP2-2AAAGGGAG0.29(7)0.04(1)0.67(16)0.310.69SNP2-3CCCTTTCT0.08(2)0.13(3)0.79(19)0.150.85SNP2-4CCCTTTCT0.13(3)0(0)0.88(21)0.130.88

括號內(nèi)數(shù)字表示該基因型在檢測群體中的觀測個數(shù)。粗體表示有義突變。

表5MyoG基因SNP位點(diǎn)的群體信息

Table 5The population information about SNPs ofMyoGgene

SNP位點(diǎn)等位基因型頻率等位基因頻率SNP3-1CCCTTTCT0.86(25)0.14(4)0(0)0.930.07SNP3-2CCGCGGCG0.10(3)0.34(10)0.55(16)0.280.72SNP3-3CCGCGGCG0.45(13)0.34(10)0.21(6)0.620.38SNP3-4CCCTTTCT0.33(7)0.33(7)0.33(7)0.500.50SNP3-5GGAGAAGA0.87(13)0.13(2)0(0)0.930.07SNP3-6AAAGGGAG0.07(1)0.40(6)0.53(8)0.270.73SNP3-7CCGCGGCG0.40(6)0.27(4)0.33(5)0.530.47

括號內(nèi)數(shù)字表示該等位基因型在檢測群體中的觀測個數(shù)。粗體表示有義突變。

根據(jù)等位基因頻率計(jì)算出群體各個基因突變位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)以及有效等位基因數(shù)(表 6)。PIC值介于0.25和0.50之間為中度多態(tài)，可知MSTN基因外顯子除了SNP1-3外，其他位點(diǎn)均為中度多態(tài)；MyoD1基因第4外顯子的1個突變位點(diǎn)SNP2-2為中度多態(tài)，MyoG基因突變位點(diǎn)SNP3-2、SNP3-3、SNP3-4、SNP3-6和SNP3-7為中度多態(tài)；所有其他突變位點(diǎn)均為低度多態(tài)。對于有效等位基因數(shù)，MSTN基因SNP1-3位點(diǎn)，MyoD1基因SNP2-1位點(diǎn)、SNP2-3位點(diǎn)和SNP2-4位點(diǎn)，MyoG基因SNP3-1位點(diǎn)和SNP3-5位點(diǎn)有效等位基因數(shù)均不超過1.4，與理論等位基因數(shù)2.0有較大差異，即這些位點(diǎn)遺傳變異較小。有效等位基因數(shù)的分析結(jié)果與多態(tài)信息含量的結(jié)果相似。

表6MSTN、MyoD1和MyoG3個基因的遺傳多樣性

Table 6Genetic diversity ofMSTN, MyoD1 andMyoGgenes

基因SNP位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)有效等位基因數(shù)(Ne)哈代-溫伯平衡(Hardy-Weinberg)MSTNSNP1-10.27181.48020.99MSTNSNP1-20.25621.43221.00MSTNSNP1-30.03571.03771.00MSTNSNP1-40.35381.84910.94MSTNSNP1-50.35381.84910.94MSTNSNP1-60.37502.00000.75MSTNSNP1-70.34111.77381.00MSTNSNP1-80.34111.77381.00MSTNSNP1-90.37211.97730.95MyoD1SNP2-10.09051.10500.96MyoD1SNP2-20.33741.75340*MyoD1SNP2-30.21811.33180.05*MyoD1SNP2-40.19481.28000*MyoGSNP3-10.12021.14730.92MyoGSNP3-20.31971.66530*MyoGSNP3-30.36001.88990*MyoGSNP3-40.37502.00000.31MyoGSNP3-50.11671.14210*MyoGSNP3-60.31461.64231.00MyoGSNP3-70.37391.99120.13

粗體表示有義突變。

2.3　突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變

MSTN、MyoD1和MyoG野生型蛋白質(zhì)及突變型蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析結(jié)果見表7。MSTN突變型蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比，除了分子量變化之外，其不穩(wěn)定系數(shù)變大(由44.80變?yōu)?5.83)，親水性變強(qiáng)(疏水性指數(shù)由-0.405變?yōu)?0.406)，其他如理論等電點(diǎn)、正負(fù)電位點(diǎn)數(shù)以及脂肪族系數(shù)均沒有變化。MyoD1突變型蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比，分子量變小，親水性變?nèi)?疏水性指數(shù)由-0.917變?yōu)?0.910)，脂肪族系數(shù)變大。MyoG突變型蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)相比，除了分子量變小之外，其理論等電點(diǎn)與不穩(wěn)定系數(shù)均變小，疏水性沒有變化。

表7蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

Table 7Protein physico-chemical properties

蛋白質(zhì)分子量理論等電點(diǎn)正電位點(diǎn)數(shù)負(fù)電位點(diǎn)數(shù)不穩(wěn)定系數(shù)總平均疏水性脂肪族系數(shù)MSTN-RAW42817.16.27464844.80-0.40580.83MSTN-SNP42847.16.27464845.83-0.40680.83MyoD1-RAW28133.16.94293074.85-0.91756.15MyoD1-SNP28115.16.94293074.85-0.91057.70MyoG-RAW25793.05.19273667.37-0.64075.68MyoG-SNP25779.05.18273665.93-0.64075.68

RAW表示野生型，SNP表示突變型。

2.4　突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化

2.4.1MSTN蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化MSTN基因外顯子1中篩查到的有義突變導(dǎo)致了第26位氨基酸由甘氨酸到絲氨酸的變化。通過軟件分析，MSTN蛋白質(zhì)在5～8位置由折疊變成了螺旋，在17～18位置、19～22位置由卷曲變成了螺旋，在136、190位置由卷曲變成了折疊(圖1)。折疊、螺旋、卷曲的比例由野生型的26.13%、15.73%、58.14%分別變成突變型的25.87%、18.13%、56.00%。

RAW表示野生型；SNP表示突變型。黑色背景表示突變型與野生型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)間有變化。H表示螺旋，E表示拉長的折疊股，C表示卷曲。括號中的數(shù)字表示每一行最后的氨基酸在蛋白質(zhì)中的位置。 圖1　MSTN野生型與突變型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的比較 Fig.1　The alignment of wild-type and mutated MSTN protein secondary structures

2.4.2MyoD1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化MyoD1基因外顯子1中的有義突變導(dǎo)致了第4位氨基酸從蛋氨酸到亮氨酸的變化。通過軟件分析，MyoD1蛋白質(zhì)在4～5位置由野生型的卷曲變成突變型的螺旋，在30位置由野生型的折疊變成突變型的卷曲(圖2)。折疊、螺旋、卷曲的比例由野生型的2.78%、26.98%、70.24%分別變成突變型的2.38%、27.78%、69.84%。

RAW表示野生型；SNP表示突變型。黑色背景表示突變型與野生型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)間有變化。H表示螺旋，E表示拉長的折疊股，C表示卷曲。括號中的數(shù)字表示每一行最后的氨基酸在蛋白質(zhì)中的位置。 圖2　MyoD1野生型與突變型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的比較 Fig.2　The alignment of wild-type and mutated MyoD1 protein secondary structures

2.4.3MyoG蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化MyoG基因的第5外顯子的一處突變導(dǎo)致了第222位氨基酸從谷氨酸到天冬氨酸的改變。通過軟件分析，MyoG蛋白質(zhì)在149、200、211位置由野生型的螺旋變成突變型的卷曲(圖3)。突變型的折疊所占比例0.88%沒有變化，螺旋、卷曲的比例分別從野生型的30.40%、68.72%變成突變型的29.07%、70.04%。

RAW表示野生型；SNP表示突變型。黑色背景表示突變型與野生型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)間有變化。H表示螺旋，E表示拉長的折疊股，C表示卷曲。括號中的數(shù)字表示每一行最后的氨基酸在蛋白質(zhì)中的位置。 圖3　MyoG野生型與突變型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的比較 Fig.3　The alignment of wild-type and mutated MyoG protein secondary structures

3討論

禽類肌肉組織肌纖維的數(shù)量在胚胎期即已確定[13]，出殼后主要是通過已有肌纖維的衛(wèi)星細(xì)胞相互融合而變得粗大[14]。肌纖維的形成與發(fā)育受到MRF家族基因的正向調(diào)控，MyoD1基因能夠?qū)⒍喾N類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成肌細(xì)胞并促進(jìn)肌細(xì)胞融合成肌管[15]，MyoG基因的表達(dá)可終止成肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)單核成肌細(xì)胞融合成多核成肌細(xì)胞[16-17]。作為肌肉的負(fù)調(diào)控因子，MSTN可以抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化[18]。MSTN不僅可以下調(diào)MyoD1基因的表達(dá)[19-20]，而且還是MyoD1的下游靶基因[21]。MSTN、MyoD1和MyoG基因三者對肌肉的調(diào)節(jié)是相互協(xié)調(diào)保持相對的平衡，因此開展MSTN、MyoD1和MyoG3個基因的SNP位點(diǎn)篩查對于生長發(fā)育有重要的科學(xué)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)高郵鴨群體MSTN、MyoD1和MyoG基因外顯子中分別有9、4和7個SNP位點(diǎn)。其中MSTN基因的所有7個SNP位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。鴨MyoD1基因和MyoG基因的多態(tài)性報(bào)道較少。Xu等在北京鴨群體中發(fā)現(xiàn)MSTN基因CDS區(qū)129位置有1個T/C突變[22]，與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的SNP1-2位點(diǎn)(CDS區(qū)第129位置)A/G突變一致。該突變位點(diǎn)2個等位基因在北京鴨上頻率接近，而在高郵鴨中A等位基因?yàn)閮?yōu)勢基因，這可能與鴨不同遺傳背景有關(guān)。除了本試驗(yàn)篩查到的MSTN基因外顯子中的7個SNP位點(diǎn)，其他研究者也發(fā)現(xiàn)了其他多個SNP位點(diǎn)[23-25]，說明MSTN基因的多態(tài)性位點(diǎn)在鴨上非常豐富。

寇潔等[26]對鴨MyoD1基因外顯子1進(jìn)行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)1處C/G的突變引起了氨基酸的變化，并且導(dǎo)致鴨屠體腿肌率的顯著增加。王瓊等[27]對優(yōu)質(zhì)肉雞研究結(jié)果表明，MyoG基因5′調(diào)控區(qū)存在影響肌纖維生長發(fā)育的SNP位點(diǎn)。這些說明MSTN、MyoD1和MyoG基因是影響禽類肌肉生長的潛在候選基因。

氨基酸的總平均疏水性可以體現(xiàn)蛋白質(zhì)的親疏水性質(zhì)，數(shù)值越高代表疏水能力越強(qiáng)，數(shù)值為負(fù)值表明該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，MyoD1突變蛋白質(zhì)相比原始蛋白質(zhì)，總平均親水性變小，即疏水性變強(qiáng)，這可能對蛋白質(zhì)的折疊以及功能的發(fā)揮有一定的影響。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，該蛋白質(zhì)可認(rèn)為是穩(wěn)定的；不穩(wěn)定系數(shù)大于40，那么該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)[29]。MSTN、MyoD1和MyoG野生型蛋白質(zhì)和突變型蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，說明這些蛋白質(zhì)均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在動物機(jī)體內(nèi)的半衰期時間較短。

基因外顯子水平上的有義突變可以影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)涉及的3個基因各有1處有義突變，通過蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這些有義突變導(dǎo)致的氨基酸變化均影響了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。其中MSTN蛋白質(zhì)2處連續(xù)的折疊和無規(guī)則卷曲均變成了螺旋結(jié)構(gòu)；MyoD1蛋白質(zhì)1處無規(guī)則卷曲變成了螺旋結(jié)構(gòu)，1處折疊變成了無規(guī)則卷曲；MyoG蛋白質(zhì)3處螺旋結(jié)構(gòu)均變成了無規(guī)則卷曲。

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(責(zé)任編輯：袁偉)

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