乳清粉對(duì)斷奶實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物區(qū)系和益生菌的影響

呂建敏，劉月環(huán)

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州　310053；2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州　310013)

乳清粉對(duì)斷奶實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物區(qū)系和益生菌的影響

呂建敏1，劉月環(huán)2

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州310053；2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州310013)

【摘要】目的利用分子生物學(xué)技術(shù)研究飼糧中添加乳清粉對(duì)斷奶早期實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物區(qū)系和益生菌的影響。方法采用單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇40日齡斷奶實(shí)驗(yàn)兔，隨機(jī)分為4組(每組12只)，分別飼以乳清粉添加水平為0%、2%、5%和10%的飼糧。飼喂30 d 后，每組隨機(jī)取8只兔，麻醉處死，取盲腸內(nèi)容物提取細(xì)菌總DNA，首先利用PCR-DGGE技術(shù)分析兔盲腸微生物區(qū)系多樣性，進(jìn)而應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green I)法定量檢測(cè)盲腸細(xì)菌中雙歧桿菌和乳酸桿菌含量。結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)兔盲腸細(xì)菌DGGE各分析參數(shù)隨乳清粉添加量的提高逐漸上升， 添加不同水平乳清粉均可顯著增加DGGE條帶數(shù)(P<0.05，P<0.01)。2%和5%乳清粉添加水平組的DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均極顯著(P<0.01)高于未添加組，但以上2項(xiàng)指標(biāo)在乳清粉各添加水平間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。DGGE均勻度指數(shù)在各實(shí)驗(yàn)組間均無(wú)差異顯著性(P>0.05)。(2)飼糧中添加乳清粉可提高實(shí)驗(yàn)兔盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，其中各乳清粉處理組(2%，5%和10%)的乳酸桿菌數(shù)量均顯著高于0%添加組(P<0.05)，10%乳清粉添加組的雙歧桿菌數(shù)量顯著高于未添加組(P<0.05)，但與其他2個(gè)乳清粉添加組無(wú)差異顯著性(P>0.05)。結(jié)論(1)飼糧中添加乳清粉可顯著提高實(shí)驗(yàn)兔盲腸細(xì)菌菌群的多樣性。(2)在實(shí)驗(yàn)兔飼糧中添加乳清粉可有效增加腸道益生菌數(shù)量。

【關(guān)鍵詞】實(shí)驗(yàn)兔；乳清粉；PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；雙歧桿菌；乳酸桿菌

乳清粉是乳品在加工乳酪過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，不僅含有大量的乳糖、乳清蛋白，而且還有B族維生素和鈣、磷等多種礦物質(zhì)。許多研究顯示，乳清粉具有促進(jìn)幼年動(dòng)物腸道發(fā)育、控制腹瀉以及增強(qiáng)免疫功能和抗氧化等作用[1-5]。目前，斷奶幼兔由腹瀉導(dǎo)致死亡問(wèn)題是困擾實(shí)驗(yàn)兔產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸之一，幼兔腹瀉的主要原因是其腸道消化機(jī)能不完善，極易受飼料和環(huán)境的影響產(chǎn)生腸道菌群失衡[6]。用抗生素治療腹瀉效果不勝理想，且國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定[7]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料中禁止添加抗生素，因此，迫切需要尋找一種安全、天然、可防治幼兔腹瀉飼料原料。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加5%乳清粉可使斷奶實(shí)驗(yàn)兔的腹瀉率由2.38%降至0%，死亡率由20%降至0%，說(shuō)明乳清粉對(duì)降低實(shí)驗(yàn)兔的腹瀉率和死亡率效果顯著[8]。據(jù)此我們推測(cè)乳清粉對(duì)幼年動(dòng)物腹瀉的防治作用可能是通過(guò)改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而要維持腸道的健康，不僅需要正常的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，還要求腸道益生菌需占優(yōu)勢(shì)地位[9]，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌是人和動(dòng)物體內(nèi)的重要益生菌[10]。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述假設(shè)，有必要對(duì)斷奶實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物區(qū)系相關(guān)特征和的益生菌數(shù)量進(jìn)行研究。在研究方法上，近年一種用于分析腸道細(xì)菌16S rRNA的分子指紋技術(shù)——變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術(shù)已廣泛用于微生物的區(qū)系結(jié)構(gòu)和分類的研究，它的優(yōu)點(diǎn)是避免了傳統(tǒng)微生物方法學(xué)在研究過(guò)程中容易產(chǎn)生的種群丟失、種群結(jié)構(gòu)不清、獲得菌群數(shù)量不足等局限性，可以直接、可靠地反映微生物的多樣性情況[11，12]。 而與傳統(tǒng)菌群培養(yǎng)鑒定、計(jì)數(shù)方法相比，目前廣泛應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏性、特異性高，污染小，計(jì)數(shù)精確等優(yōu)點(diǎn)[9,13，14]。本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE和實(shí)時(shí)熒光定量等分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)幼兔盲腸內(nèi)容物標(biāo)本進(jìn)行微生物區(qū)系分析和雙歧桿菌與乳酸桿菌計(jì)數(shù)，以期較深入闡明乳清粉對(duì)實(shí)驗(yàn)兔腸道微生態(tài)的作用機(jī)制，為合理開(kāi)發(fā)乳清粉特色產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

普通級(jí)日本大耳白兔48只，雌雄各半，40日齡(剛斷奶)，體質(zhì)量為1.0～1.2 kg，按所采食飼糧中乳清粉含量不同隨機(jī)分為A、B、C、D共4組(即A～D組試兔分別采食乳清粉添加水平為0%，2%，5%和10%的4種飼糧)。實(shí)驗(yàn)兔由浙江省新昌縣大市聚鎮(zhèn)興達(dá)兔場(chǎng)提供【SCXK(浙)2010-0042】(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0010993)，實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中普通級(jí)兔飼養(yǎng)室【SYXK(浙)2008-0116】中進(jìn)行，環(huán)境溫度為 (22±1)℃，相對(duì)濕度為50%～70%，氨濃度≤14 mg/m3， 光照：150-200 Lx，12 h/12 h 明暗交替，噪音<50 dB。所有實(shí)驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，早、中、晚各喂1次全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料(飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平參見(jiàn)文獻(xiàn)8)，自由飲水，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的 3R 原則給予人道的關(guān)懷。試兔經(jīng)7 d預(yù)試期適應(yīng)后進(jìn)行為期30 d的正式實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop 2000，由Thermo公司制造)，用于所提取DNA的濃度和純度測(cè)定。東勝龍PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn))，用于普通PCR。DGGE瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))，用于變性梯度凝膠電泳。Real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(FX96 Real-Time PCR System，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))，用于熒光定量PCR。

飼料級(jí)乳清粉(粗蛋白含量為12%，乳糖含量為(65～70)%，購(gòu)自美國(guó)Saputo公司。雙歧桿菌(植物雙歧桿菌)和乳酸桿菌(凍干乳酸菌原料菌粉)標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)自拜弗德生物科技有限公司及中科嘉億生物工程公司。PCR試劑由上海華津生物技術(shù)公司生產(chǎn)。DGGE試劑由Sigma公司生產(chǎn)。細(xì)菌熒光定量PCR試劑來(lái)自于杭州欣越生物技術(shù)公司，為標(biāo)記為SYBR Green I熒光染料的整套試劑。

1.3方法

1.3.1盲腸內(nèi)容物標(biāo)本收集與保存：在正試期第30天，分別從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取試兔8只，麻醉處死，解剖，取盲腸內(nèi)容物立即置入無(wú)菌離心管，-80℃凍存，備用。

1.3.2細(xì)菌總DNA抽提：用酚-氯仿方法提取。取0.1 g盲腸內(nèi)容物，抽提細(xì)菌基因組DNA：將樣品懸浮于900 μL PBS溶液， 洗滌、離心2次棄上清液， 加入400 μL裂解液(100 mg/L蛋白酶K，10 mmol/L Tris-HCI，15 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，4 g/L SDS pH 8.0)重懸細(xì)胞，37℃保溫(12～24) h后再加450 μL平衡酚，混勻，5 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相重復(fù)酚抽提1次。再轉(zhuǎn)移上層水相，加入450 μL氯仿：戊醇(24:1)，混勻，5 000 r/min離心10 min。再轉(zhuǎn)移上層水相，加入3 mol/L乙酸鈉(pH 5.2)1/10體積和無(wú)水乙醇2.5倍體積，混勻，置-20℃ 1 h后， 10 000 r/min離心15 min。以700 mL/L乙醇洗滌2次，晾干后，加入50 μL TE，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，計(jì)算濃度和比值，判斷所提取DNA的濃度和純度，應(yīng)用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，產(chǎn)物置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3盲腸微生物區(qū)系PCR-DGGE分析：利用1.3.2從盲腸內(nèi)容物中提取的細(xì)菌總DNA，進(jìn)行盲腸微生物區(qū)系PCR-DGGE分析，方法如下：

1.3.3.1細(xì)菌16S rDNA V6-V8區(qū) 擴(kuò)增：參照文獻(xiàn)[15] 進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V6-V8區(qū) 擴(kuò)增，所采用一對(duì)細(xì)菌通用引物序列為：上游引物為5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC，下游引物為5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC，PCR產(chǎn)物片段大小為470 bp，由上海華津生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系和條件為同文獻(xiàn)[15]。PCR 反應(yīng)結(jié)束按文獻(xiàn)[15]方法鑒定PCR產(chǎn)物。

1.3.3.2變性梯度凝膠電泳(DGGE):參照文獻(xiàn)[15]配制濃縮膠和高低濃度變性膠，用梯度混合儀制備變性梯度凝膠，點(diǎn)樣后進(jìn)行電泳，電泳條件同文獻(xiàn)[15]。

1.3.3.3銀染及凝膠成像：電泳結(jié)束后，參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行硝酸銀染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3.4DGGE圖像分析：采用Gel-pro4.5軟件和Past軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行處理，分析DGGE條帶數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)等指標(biāo)。

1.3.4盲腸中益生菌數(shù)量熒光定量PCR檢測(cè)：

1.3.4.1益生菌特異性引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中提供的16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)2種益生菌(雙歧桿菌和乳酸桿菌屬)特異性引物(genum-specific primers)，雙歧桿菌的上游引物為gaaagccaattacggacggaag，下游引物為tgggttatacccgcctttgac，PCR產(chǎn)物片段大小為180 bp；乳酸桿菌的上游引物為accagtgttgggatgttcgaac，下游引物為taaccaaccgttagtggcgc，PCR產(chǎn)物片段大小為144 bp。以上2組引物對(duì)由上海華津生物技術(shù)公司合成。

1.3.4.2標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA抽提及引物對(duì)特異性檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)選擇由拜弗德生物科技有限公司生產(chǎn)的植物雙歧桿菌(Bifido-bacteriumadolescentis)和由中科嘉億生物工程公司生產(chǎn)的凍干乳酸菌原料菌粉(Lactobacillisplantarum)作為標(biāo)準(zhǔn)菌株。分別稱取上述菌粉各0.1g按 1.3.2步驟進(jìn)行細(xì)菌基因組 DNA 抽提， DNA樣品置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取以上 2 種菌株基因組 DNA 抽提液進(jìn)行常規(guī)PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件同文獻(xiàn)[9]。應(yīng)用1.1%的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小與預(yù)先設(shè)計(jì)的是否一致，以確定引物的特異性。

1.3.4.3擴(kuò)增曲線與靈敏度檢測(cè)：將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋法做10倍系列稀釋，使其形成107～102拷貝/μL，經(jīng)Real-time PCR反應(yīng)后得到模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。

1.3.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線制作：將雙歧桿菌和乳酸桿菌的DNA提取物經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，換算成雙歧桿菌和乳酸桿菌的拷貝數(shù)，按文獻(xiàn)[9]方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，real-time PCR反應(yīng)體系和條件同文獻(xiàn)[9]。反應(yīng)結(jié)束按儀器操作說(shuō)明選擇熔解曲線分析，自動(dòng)采集熒光，制作熔解曲線。

1.3.4.5幼兔盲腸內(nèi)容物雙歧桿菌和乳酸桿菌含量檢測(cè)：按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)體系和條件分別對(duì)各組待測(cè)樣品的DNA抽提液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異分析和多重比較。

2結(jié)果

2.1盲腸微生物菌群DGGE分析結(jié)果

2.1.1盲腸細(xì)菌16S rDNA V6-V8 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：由圖1(PCR產(chǎn)物的電泳圖譜)可見(jiàn)， 每個(gè)樣品均出現(xiàn)一條特異性的PCR產(chǎn)物片斷，與marker對(duì)比，該片段大小在500 bp左右，與設(shè)計(jì)所預(yù)期的一致。

圖1　盲腸細(xì)菌V6-V8 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of bacterial V6-V8 PCR products from ceacal microbes

圖2　A、B、C、D組盲腸細(xì)菌區(qū)系DGGE圖譜Fig.2　DGGE profile of ceacal bacterial community in the groups A, B, C and D

各實(shí)驗(yàn)組盲腸微生物菌群DGGE圖譜及DGGE參數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖2和表1，由表1可見(jiàn)，隨著乳清粉添加水平提高，DGGE各分析參數(shù)都呈上升趨勢(shì)。添加乳清粉可顯著提高實(shí)驗(yàn)兔盲腸菌群的DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)：添加乳清粉各組(B、C、D組)的DGGE條帶數(shù)均顯著高于未添乳清粉的A組(P<0.05)，且C、D組的DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)與A組差異極顯著(P<0.01)。添加乳清粉對(duì)盲腸菌群的DGGE均勻度指數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)兔飼糧中添加乳清粉可顯著提高盲腸微生物菌群的多樣性。

2.2盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2.1Real-time PCR可靠性分析：雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線見(jiàn)圖3、圖4和圖5。由圖3(雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光曲線)可見(jiàn)不同拷貝數(shù)的模板熒光曲線均呈“S”型，且實(shí)驗(yàn)所用的雙歧桿菌和乳酸桿菌引物對(duì)的擴(kuò)增靈敏度均小于100 CFU/mL。圖4顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增線性范圍為102～107，線性相關(guān)系數(shù)為0.989~0.999。圖5為陽(yáng)性模板的熔解曲線，可見(jiàn)2種細(xì)菌的熔解曲線呈單峰，雙歧桿菌的Tm為86.9，乳酸桿菌的Tm值為83.5。

以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所建立的熒光定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增靈敏度好，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)程度高，因此具有很好的可靠性。

2.2.2樣品雙歧桿菌和乳酸桿菌含量測(cè)定結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組幼兔盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量見(jiàn)表2：隨著實(shí)驗(yàn)兔飼量中乳清粉添加量的提高，幼兔盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量都呈上升趨勢(shì)，其中，B、C、D組(2%、5%和10%乳清粉添加組)的乳酸桿菌的含量均顯著(P<0.05)高于A(0%)組； D組的雙歧桿菌含量顯著高于A和B組(P<0.05)，與C組無(wú)差異顯著性(P>0.05)。

表1　盲腸微生物菌群DGGE參數(shù)分析結(jié)果

注：同行無(wú)字母或數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note. In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01). The same as in table 2.

圖3　雙歧桿菌與乳酸桿菌熒光曲線 Fig.3　Fluorescence curves of Bifidobacteria and Lactobacillus

圖4　雙歧桿菌(A)與乳酸桿菌(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(擴(kuò)增線性范圍102~107，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.989~0.999)Fig.4　Standard curves of the real-time fluorescence quantitative PCR of Bifidobacteria (A) and Lactobacilli (B). The linear range of amplification varied between 102 -107 genomes, depending on the genome size of the target species. Standard curves had correlation coefficient values between 0.989-0.999)

圖5　雙歧桿菌和乳酸桿菌的熔解曲線Fig.5　Dissociation curves of amplification products ofBifidobacteria and Lactobacillus

3討論

腸道微生態(tài)環(huán)境對(duì)動(dòng)物腸道甚至整個(gè)機(jī)體的健康起著重要作用，因此如何選擇一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的腸道微生物研究方法對(duì)深入研究腸道微生態(tài)就顯得尤為必要。傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還存在容易引起種群丟失、種群結(jié)構(gòu)不清等弊病，并且由于個(gè)別菌種難以培養(yǎng)，不能準(zhǔn)確地反映腸道菌群結(jié)構(gòu)和細(xì)菌數(shù)量，大大阻礙了腸道微生態(tài)研究發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為深入研究腸道菌群結(jié)構(gòu)特征及細(xì)菌定量提供了便利。目前應(yīng)用最廣泛的就是用于腸道微生物遺傳特性和分類研究的變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術(shù)和用于細(xì)菌定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11-14]。本實(shí)驗(yàn)利用PCR-DGGE和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)兔盲腸微生物區(qū)系的多樣性和相關(guān)益生菌數(shù)量，結(jié)果顯示：本實(shí)驗(yàn)所建立的PCR-DGGE體系可準(zhǔn)確獲得細(xì)菌16S rDNA的V6-V8區(qū)PCR產(chǎn)物特異性片段，并獲得了較清晰的DGGE圖譜，可順利進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的分析；實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系也具有較高的靈敏度(擴(kuò)增靈敏度小于100 CFU/mL)，可靠性(熔解曲線顯示為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一)和準(zhǔn)確性(利用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈強(qiáng)線性相關(guān))，類似于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9,14，15]。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所建立DGGE-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系是可行的，值得在實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物研究中推廣應(yīng)用。

表2　雙歧桿菌和乳酸桿菌的實(shí)時(shí)定量結(jié)果 (log 10 N /0.05 g 盲腸內(nèi)容物,

以往研究表明，乳清粉對(duì)防止幼年動(dòng)物腹瀉，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)起到重要作用[1,2,8,16，17]，但對(duì)乳清粉抗腹瀉作用的機(jī)制研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)較深入研究了乳清粉對(duì)實(shí)驗(yàn)兔腸道微生物區(qū)系多樣性和益生菌數(shù)量消長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)斷奶實(shí)驗(yàn)兔采食含一定量乳清粉飼糧1個(gè)月后，盲腸菌群的DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)(反映腸道微生物多樣性的指標(biāo))顯著提高，盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量也顯著增加，且DGGE條帶數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量均隨乳清粉添加量的增加呈上升趨勢(shì)。該結(jié)果充分驗(yàn)證了我們前期的推測(cè)，并可由此得出乳清粉抗腹瀉作用的可能的機(jī)制為：一方面，乳清粉中所含有乳糖可為腸道中乳酸菌發(fā)酵提供大量底物，不僅可促進(jìn)乳酸菌的繼續(xù)增殖，而且乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸可促使腸道pH下降，能促進(jìn)其他益生菌增殖，提高菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，抑制有害菌生長(zhǎng)；另一方面，乳清粉中含有多種乳蛋白(乳鐵蛋白、免疫球蛋白、支鏈氨基酸等)，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫等生物活性作用[5]，對(duì)于維持腸道正常菌群結(jié)構(gòu)，提高菌群多樣性起到積極作用。本研究充分驗(yàn)證了乳清粉具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)益生菌增殖的作用，為乳清粉作為一種抗腹瀉的天然飼料原料應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)中提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李軍平. 添加乳清粉和添加高銅高鋅日糧對(duì)斷奶前后仔豬生產(chǎn)性能的影響 [J]. 中國(guó)養(yǎng)豬業(yè), 2012, 9: 43-45.

[2]Kobayashi Y, Itoh A, Miyawaki K, et al. Effect of liquid whey feeding on fecal microbiota of mature and growing pigs [J]. Animal Sci J, 2011, 82(4): 607-615.

[3]Gad AS, Khadrawy YA, El-Nekeety AA, et al. Antioxidant activity and hepatoprotective effects of whey protein and Spirulina in rats [J]. Nutrition, 2011, 27(5): 582-589.

[4]Beaulieu J, Dupont C, Lemieux P. Whey proteins and peptides: beneficial effects on immune health [J]. Therapy, 2006, 3(1): 69-78.

[5]Bulut Solar B, Akin N. Functionality of whey protein [J]. Int J Health Nutr, 2012, 3(1): 1-7.

[6]王仲兵. 微生物制劑對(duì)幼兔腹瀉治療的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2007, 29(6): 475-478.

[7]中華人民共和國(guó)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB 14924.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料通用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2001.

[8]呂建敏, 蔡兆偉, 蔡月琴, 等. 乳清粉對(duì)斷奶實(shí)驗(yàn)兔生長(zhǎng)性能、抗氧化及免疫功能的影響 [J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2013, 25(13): 2951-2957.

[9]王翔, 陳津津, 洪莉, 等. 外源性雙歧桿菌對(duì)腸外營(yíng)養(yǎng)幼兔腸道益生菌的影響 [J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2007, 29(6): 573-577.

[10]常維山, 牛鐘相, 朱瑞良, 等. 兔腸道正常微生物群的研究 [J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 1996, 8: 14-16.

[11]付琳林, 李海星, 曹郁生. 利用變性梯度凝膠電泳分析微生物多樣性 [J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2004, 2: 39-40.

[12]徐博文, 張琦. PCR-DGGE技術(shù)在動(dòng)物胃腸道菌群多樣性研究中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2013, 49(10): 55-57.

[13]吳燕濤, 劉曉莉, 曹悅, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定發(fā)酵乳中雙歧桿菌 [J]. 食品科學(xué), 2013, 34(08): 172-175.

[14]宋美茹, 姚萍. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR定量檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎腸道大腸埃希菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌屬的變化 [J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 24(3): 239-243.

[15]呂建敏. 實(shí)驗(yàn)兔新品系(WHBE兔)蛋白質(zhì)需要特點(diǎn)及相關(guān)機(jī)理研究 [D]. 博士學(xué)位論文. 杭州: 浙江大學(xué), 2009: 56-59.

[16]易永宏. 日糧乳清粉含量對(duì)乳豬生產(chǎn)性能的影響 [J]. 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué), 2005, 22(5): 50-51.

[17]穆曉峰, 雷華. 日糧中添加乳清粉和膨化豆粕對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能影響 [J]. 畜牧與獸醫(yī), 2007, 39(8): 30-31.

〔修回日期〕2015-06-28

研究報(bào)告

Effects of dried whey on the intestinal bacterial community and

probiotics in weaned laboratory rabbits

LV Jian-min1，LIU Yue-huan2

(1. Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China；

2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)

【Abstract】Objective To investigate the effects of dried whey on the intestinal bacterial community and probiotics in weaned laboratory rabbits. Methods A single factor design was employed to investigate the effects of dried whey supplemented at levels of 0%, 2%, 5% and 10%, respectively, on 48 weaned (40-day-old) laboratory rabbits. At the day 30, eight rabbits in each group were taken and sacrificed after anesthesia. The total bacterial DNA from the ceacal content of each selected rabbit was drew to analyze the bacterial community and intestinal probiotics (Bifidobacterium and Lactobacillius) population by PCR-DGGE and real-time fluorescence quantitative PCR, respectively. Results1) The DGGE parameters of ceacal bacterial community were increased with the increasing dried whey supplemental levels. The number of DGGE band in 2%, 5% and 10% dried whey supplement groups (P<0.05, P<0.01), the Shannon index in 5% and 10% supplement groups (P<0.01) were significantly higher than that in the 0% supplement group, but the indices of DGGE band and Shannon index had no significant differences among the 2%, 5% and 10% dried whey supplement groups (P>0.05). Supplying dried whey has no significant effects on the homogeneity index (P>0.05). 2) The population of Bifidobacterium and Lactobacillius in ceacal content had a trend of increase with the rising dried whey supplement levels. Compared with the 0% supplement group, the Lactobacillius populationin the 2%, 5% and 10% supplement groups (P<0.05), the Bifidobacterium population in the 10% supplement group (P<0.05) were significantly increased. ConclusionsThe results of our study indicate that: 1) Supplying dried whey in the feed of laboratory rabbit can effectively increase the diversity of ceacal bacterial community. 2) Dried whey may effectively improve the intestinal probiotics population.

【Key words】Laboratory rabbits；Dried whey；PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); Real-time fluorescence quantitative PCR; Bifidobacterium；Lactobacillius

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.003

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 08-0012-06

[通訊作者]劉月環(huán)(1974-)，女，副研究員，博士，研究方向：生物技術(shù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種。 Email: yuehuanliu@163.com。

[作者簡(jiǎn)介]呂建敏(1971-)，女，研究員，博士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫。E-mail: ljm6666@163.com。

[基金項(xiàng)目]浙江省科技廳資助 (編號(hào)：2008F0003)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金(編號(hào)：XTD201301)。