高糖高脂飲食誘導大鼠代謝綜合征模型并發(fā)阿爾茨海默樣變

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(1. 山西醫(yī)科大學病理生理學教研室，太原　030001；2.山西醫(yī)科大學肝病研究所，太原　030001；

3.山西省人民醫(yī)院病理科，太原　030012)

高糖高脂飲食誘導大鼠代謝綜合征模型并發(fā)阿爾茨海默樣變

牛利1,2，韓德五2，許瑞齡1,2，周鑫1,2，屈重霄3

(1. 山西醫(yī)科大學病理生理學教研室，太原030001；2.山西醫(yī)科大學肝病研究所，太原030001；

3.山西省人民醫(yī)院病理科，太原030012)

【摘要】目的通過長期高糖高脂飲食導致動物出現代謝綜合征合并阿爾茨海默(AD)樣改變動物模型的研究。方法將48只SD大鼠隨機分為2組，正常對照組(用普通飼料飼喂) 24只，高糖高脂組( 飼以高糖高脂飼料)24只，連續(xù)喂養(yǎng)12 個月。于實驗第 6、9、12月末觀察動物體重、腎周和附睪或子宮周圍脂肪重量并計算Lee指數; 檢測血液中代謝綜合征相關生化指標的變化；Western blotting測定海馬Tau蛋白含量及其磷酸化水平；ELISA法檢測海馬Aβ的含量；HE染色觀察腦組織病理改變。結果與正常對照組相比，各階段高糖高脂組大鼠體重、內臟脂肪重量明顯增加; 血清中FPG、TG、LDL等明顯升高，HDL顯著下降；海馬Aβ、P-tau較對照組明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義;病理組織學顯示模型組腦組織有明顯的炎性浸潤、小膠質細胞活化明顯。結論高糖高脂飲食誘導大鼠代謝綜合征動物模型可并發(fā)AD樣變，可為老年癡呆動物模型的構建提供一個新的思路。

【關鍵詞】阿爾茨海默病;代謝綜合征;炎癥;胰島素抵抗;高糖高脂

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，本病起病緩慢隱匿，病程呈進行性，病因迄今未明。AD患者最典型的臨床表現是學習，記憶和認知功能的進行性減退，其海馬組織中tau蛋白過度磷酸化和Aβ聚集形成SP，被認為是AD特征性病理改變[1]。AD 中，5%的病例為家族性AD(FAD)，95%的病例為散發(fā)性AD(SAD)[2]。SAD 是一種與年齡密切相關的疾病，是遺傳與環(huán)境相互作用的結果，但其確切原因和發(fā)病機制目前尚不明確。對于AD的研究目前大多采用轉基因動物，但其無法模擬人類緩慢發(fā)病的進程，因此有著的局一定的限性。

代謝綜合征(MS)是以胰島素抵抗為核心的各種代謝疾病的總稱，是糖代謝異常、2型糖尿病、高血壓、脂代謝紊亂、腹型肥胖，高胰島素血癥等多種代謝異常集簇發(fā)生在某一個體的異常病理生理現象。大量的研究表明，與代謝綜合征相關的糖尿病、高血壓、肥胖等往往是AD潛在的獨立危險因素[3,4],故代謝紊亂可能是AD發(fā)病的始動因子[5]。本課題組采用高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠一年，成功復制出肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病、代謝性心肌病等代謝綜合征相關疾病的動物模型[6]。本實驗在此工作基礎上，對高糖高脂誘導的代謝綜合征大鼠模型的腦組織的相關指標進行測試和分析，力求尋找AD與代謝綜合征的早期聯(lián)系。

1材料和方法

1. 1實驗動物

Sprague-Dawley 大鼠48只，雌雄各半，山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，生產許可證：SCXK(晉) 2009-0001，動物使用許可證：SYXK(晉)2009-0004。

1.2主要試劑和儀器

甘油三酯( triglyceride，TG) 試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒等購自中生北控公司；AβELISA試劑盒購自R&D；Tau、P-tau抗體購自Cell Signaling Technology；721 分光光度計購自上海第三分析儀器廠; SN-684 型放免 γ 計數器購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

1.3動物分組及模型的建立

48只大鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后，隨機分為 6 組: 6 月、9月、12月正常對照組，每組8只，以正常飲食喂養(yǎng); 6月、9月、12月高糖高脂組，每組8只，采用高糖高脂膳食( 70% 正常飼料 + 20% 豬油 + 10% 蔗糖 +1% 膽 固 醇 + 0. 25% 膽 酸 ) 喂 養(yǎng)。正常組總熱量13. 89 KJ / g，模型組總熱量 68. 40 KJ / g。以上動物均于天黑前投食，自由飲水，每月末稱體重1次。分別于實驗第 6月末、9 月末、12月末取相應階段的正常組及高糖高脂組大鼠，腹主動脈采血，3 500 r/min 離心備用; 斷頭處死，取腦組織一半于10% 中性甲醛固定液中固定，石蠟包埋切片。另一半凍存于-70℃冰箱待用。

1.4生化指標檢測

嚴格按照試劑盒說明書進行。計算胰島素抵抗指數( HOMA-IR) :HOMA-IR=( FPG×FINS) /22. 5。

1. 5病理學檢查

10%中性甲醛溶液固定腦組織進行 HE 染色，光鏡下觀察腦組織病理學改變。

1. 6蛋白質印跡技術檢測海馬內Tau、P-tau蛋白的水平

取凍存的海馬組織分別置于玻璃勻漿器內,加入蛋白裂解液在冰浴中反復研磨，裂解30 min, 于4℃離心機內12 000 r/min離心10 min,取上清液即為蛋白，取10 μL用Bradford法檢測蛋白濃度,其余儲存于-80℃?zhèn)溆?，調整各上樣量40 μLwell，用前加2×樣本緩沖液并混勻,于100℃變性5 min, 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳, 4℃ PVDF轉膜過夜，搖床上5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;分別與目的抗體4℃雜交過夜；PBST洗膜3次,每次10 min;雜交2抗(辣根酶標記的羊抗兔),室溫搖床上孵育2 h；PBST洗膜3次,每次10 min; 加入發(fā)光液、曝光、顯影，采用Quantity One (Bio-Rad Laboratories)對膠片進行灰度分析。

1.7統(tǒng)計學方法

2結果

2.1大鼠體重及內臟脂肪重量的變化

2.2代謝綜合征相關指標的變化

模型組大鼠TG、LDL、FPG、HOMA-IR 等都明顯升高(P<0.05)，HDL則明顯降低。說明經過高糖高脂喂養(yǎng)后，動物出現了糖代謝異常，高甘油三酯血癥，異常脂蛋白血癥及胰島素抵抗等一系列代謝綜合癥相關特征(表1)。

2.3 tau蛋白與Aβ的表達

圖2 結果表明，模型組動物P-tau(s199)在6月就明顯升高，9月達到最高值，且持續(xù)到12月仍較正常組明顯升高；而P- tau(s396)在9月明顯升高且達到最高值，一直持續(xù)到12月。模型組動物Aβ的表達在6,9,12月均明顯高于正常組，其差異具有顯著性。

2.4腦組織皮層病理學觀察

圖3(見文后彩插1)結果表明，正常組動物腦組織結構正常，模型組動物6月開始出現少量炎性細胞浸潤，到12月時炎性細胞浸潤最為嚴重。

3討論

AD是一種中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，起病徐緩，病程呈進行性，病因迄今未明。由于人均壽命延長，老年人口迅速增長，AD患病人數必然相應增加，已成為許多國家的主要保健和社會問題之一。Yaffe等[7]對2 632名患者追蹤調查結果表明，MS是認知功能下降的高危險因素。因此本實驗在高糖高脂誘發(fā)代謝綜合征模型基礎上對動物腦組織進行了相關的研究，以求進一步發(fā)現AD與MS在早期的聯(lián)系。我們的實驗結果顯示，模型組動物在出現代謝指標變化的同時會出現AD相關的特征性病理改變。且HE染色顯示，模型組動物腦組織有大量炎性細胞的浸潤，隨著時間的推遲，炎性細胞浸潤逐漸增多。目前認為，炎癥是引起Aβ沉積的繼發(fā)性反應，也是導致神經元退行性變的重要因素。外周炎癥因子通過活化腦血管內皮細胞進入腦內，可引起中樞炎癥反應，進而影響認知功能[8]，同時炎癥因子激活腦內小膠質細胞，活化后的小膠質細胞又可分泌更多的炎癥因子，從而形成惡性循環(huán)，使腦內炎癥放大。McDonald等[9]研究表明 激活的小膠質細胞可產生大量的APP，成為更多 Aβ 的來源。Tamagno 等[10]的研究亦提示 Aβ 所致氧化應激生成的過氧化產物能夠上調 β 分泌酶的表達，從而加快 APP 的異常剪切，產生更多的 Aβ。腦內炎癥不僅促進腦內淀粉樣蛋白 Aβ的聚集，還可使tau蛋白的過度磷酸化，從而促進AD發(fā)生。

注：NC:正常組動物；HSHF：高糖高脂組動物；VF: 內臟脂肪重量; BW: 體重。圖1　體重、內臟脂肪、Lees指數的變化 Note.NC: Normal control group; HSHF: Model groups established by high-sugar high-fat diet. VF: Visceral fat weight; BW: Body weight.Fig.1　Changes of body weight, visceral fat, and Lee’s index in the rats.

甘油三酯(TGmmol/L)高密度脂蛋白(HDLmmol/L)低密度脂蛋白(LDLmmol/L)血糖(FPGmmol/L)胰島素抵抗指數(HOMA-IR)對照組(Control)0.080±0.0291.784±0.14120.622±0.1135.099±0.6291.685±0.1776月模型組(6M)0.556±0.151**0.501±0.112**2.878±0.337*11.709±0.471*3.604±0.202*9月模型組(9M)0.570±0.176**0.477±0.179**3.440±0.127**13.784±0.141**3.570±0.184**12月模型組(12M)0.562±0.143**0.434±0.125**3.447±0.099**14.657±0.171**3.390±0.227**

注：與對照組比較*P<0.05,**P<0.001。Note：compared with the control*P<0.05,**P<0.001.

注：N：正常組動物；6M：6月高糖高脂組；9M：9月高糖高脂組；12M：12月高糖高脂組；*P<0.05與正常組比較；# P<0.05與6月高糖高脂組比較。圖2　腦組織Tau蛋白與Aβ含量Note: N: Control group; 6M: High-sugar high-fat diet for 6 months; 9M: High-sugar high-fat diet for 9 months; 12M: High-sugar high-fat diet for 12 months. *P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with the 6M group.Fig.2　Expressions of Tau proteins and Aβ in the brain tissue

中樞性胰島素抵抗也是大家公認的SAD發(fā)病機制之一。胰島素信號轉導通路在中樞神經系統(tǒng)內廣泛存在，其通路異?？捎绊懩X內葡萄糖的代謝水平，而葡萄糖是腦內供應能量的主要物質。IR的產生不僅會影響腦組織的能量利用，同時也擾亂了大腦神經中樞信號的傳遞，因而導致患者認知功能障礙的發(fā)生。多項研究表明，胰島素抵抗與認知功能下降或AD的危險性具有明顯的相關性[11]。本實驗通過長期高糖高脂飼養(yǎng)動物，出現了一系列代謝綜合征相關疾病的動物模型，其基本特征除炎癥外均存在胰島素抵抗。外周炎癥可參與并促進IR的發(fā)生，我們推測中樞的炎癥同樣也可促進中樞IR的發(fā)生;而且高糖高脂喂養(yǎng)大鼠模型在早期就已出現了肥胖[12]，導致體重和內臟脂肪含量明顯增加，脂肪細胞發(fā)生分化異常，引起游離脂肪酸(FFA)水平增加并導致異位沉積。FFA增加與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關，可以影響胰島素信號轉導通路，抑制外周組織及中樞對葡萄糖的攝取，使葡萄糖氧化和非氧化利用發(fā)生障礙。因此，高脂飲食可通過影響胰島素信號轉導通路導致外周 IR，其胰島素受體數目、PI-3K,PKB 及 GLUT4 水平在高脂飲食后均有所改變。腦內的IR 不會因高濃度的胰島素水平，而下調其在細胞膜上的表達，但其與胰島素的結合受饑餓、肥胖、老化和地塞米松治療的影響。本實驗后續(xù)結果顯示，高糖高脂飲食同樣可以通過影響胰島素信號轉導通路使中樞發(fā)生IR, PI-3K, PKB, 及GLUT3水平均會發(fā)生改變。

綜上所述，動物在高糖高脂飲食喂養(yǎng)下，除可發(fā)生代謝綜合癥相關疾病，還可導致AD樣改變，可作為研究早期老年癡呆較為貼合人類實際的動物模型。

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〔修回日期〕2015-06-17

研究報告

Alzheimer’s disease-like lesions may occur in and accompany the

high-sugar high-fat diet-induced rat models of metabolic syndrome

NIU Li1，2, HAN De-wu2, XU Rui-ling1,2, ZHOU Xin1，2, QU Chong-xiao3

(1. Department of Pathophysiology, 2. Institute of Liver Disease, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;

3. Department of Pathology, People’s Hospital of Shanxi Province, Taiyuan 030012

【Abstract】ObjectivesTo explore the relativity between Alzheimer’s disease (AD)-like lesions and metabolic syndrome models induced by high-sugar high-fat diet in rats. Methods Forty-eight Sprague Dawley rats were randomly divided into 2 groups．The control group (fed with normal diet, 12 rats) and high sugar and high fat group (fed with high-sucrose and high-fat diet, 12 rats) continuously for 12 months. At the end of 6, 9 and 12 months of the experiment, we observed the animal body weight and visceral fat weight. The blood lipid levels, blood glucose and MS-related biochemical parameters were determined. The brain tissues were examined by histopathology. The characteristic AD molecules hippocampus Aβ and Tau were detected using ELISA and Western blotting to confirm the presence of AD lesions in the brain. ResultsCompared with the normal control group, the body weight and visceral fat weight of the rats in the high-sugar high-fat groups were significantly increased; the levels of TG, FPG, LDL, HOMA-IR and hippocampus Aβ, phosphorylated Tau (p-Tau) were higher, but the level of HDL was decreased (P<0.05 for all)．The histopathological examination revealed inflammatory cell infiltration in the brain tissues. ConclusionsCharacteristic AD-like lesions may occur and accompany the rat models of metabolic syndrome, induced by high-sugar high-fat diet, and provide a new idea for the construction of Alzheimer’s disease animal models.

【Key words】Metabolic syndrome; Alzheimer’s disease, sporadic; Inflammation; Insulin resistance; High-sugar high-fat diet; Rats

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.006

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0027-04

[通訊作者]韓德五(1934-)，男，教授，研究方向：腸源性內毒素血癥與代謝綜合征。Email: 535574141@qq.com。

[作者簡介]牛利(1976-)，女，講師，研究方向：代謝綜合征與老年癡呆。E-mail: nltys2004@163.com。

[基金項目]國家自然科學青年基金(No. 81302220)；山西省自然科學青年基金(編號：2014021040-3)。