Beagle犬血液標(biāo)本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測的影響

余增才，陳潔君，孫晶晶，郭秋平

(廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州　510240)

Beagle犬血液標(biāo)本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測的影響

余增才，陳潔君，孫晶晶，郭秋平

(廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州510240)

【摘要】目的探索Beagle犬分離后的血清在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測的影響，保證長期毒性試驗中檢測結(jié)果的可靠性。方法選取Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬靜脈血，制備血清后，分別在1 h內(nèi)、冰箱(2～8)℃保存2、5、8、12 h、冰盒(2～10)℃中進(jìn)行運輸保存2、5、8 h、冰箱-20℃保存1、3、5 d對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、總膽紅素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、鈣(CA)、乳酸脫氫酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、鈉(Na+)/鉀(K+)/氯(Cl-)進(jìn)行檢測。結(jié)果(2～8)℃冰箱保存12 h內(nèi)和(2～10)℃冰盒保存8 h內(nèi)的血液生化值均無差異；與血清分離后1 h內(nèi)結(jié)果比較， -20℃保存5 d的LDL-C差異有顯著性(P<0.05)且變動百分率為39%， CK、LDH值有逐漸增大的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LDH的變動百分率達(dá)41%。結(jié)論根據(jù)Beagle犬血液標(biāo)本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果的影響的試驗結(jié)果，在制備血清后，應(yīng)該在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測，如未能在樣本制備后1 h內(nèi)檢測，應(yīng)將樣本置于(2～8)℃環(huán)境并在12 h內(nèi)進(jìn)行檢測，或置于約-20℃環(huán)境并在3 d內(nèi)進(jìn)行檢測。要對血清標(biāo)本進(jìn)行運輸?shù)?，?yīng)放置于冰盒(2～10℃)中，并在8 h內(nèi)進(jìn)行檢測。

【關(guān)鍵詞】犬，Beagle；保存條件；保存時間；血液生化指標(biāo)

Beagle犬為新藥安全性評價的常用動物，血液生化指標(biāo)為長期毒性試驗的常規(guī)檢測指標(biāo)[1,2]。血液生化指標(biāo)檢測是通過生物或化學(xué)方法檢測血液中的各項指標(biāo)的變化[3]，從而反映出受檢者的健康情況，但不同的保存條件和保存時間的長短都會直接影響生化指標(biāo)的檢測結(jié)果，所以保證血液標(biāo)本的保存質(zhì)量具有十分重要的意義[4]。而制備分離后的待測血樣如果不能及時進(jìn)行生化測定，必然涉及到保存問題[5]，本實驗通過采取不同保存條件和保存時間進(jìn)行保存血標(biāo)本，分別檢測不同保存條件和保存時間后血標(biāo)本的各項生化指標(biāo)變化情況，為藥物非臨床評價中心實行多場所管理和外單位或異地送檢血液生化學(xué)檢查標(biāo)本提供參考和數(shù)據(jù)支持。

1材料和方法[6,7]

1.1實驗動物及飼養(yǎng)條件

1.1.1實驗動物：6～10月齡普通級Beagle犬6只，(6～10)kg，雌雄各半。由廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院實驗動物研究開發(fā)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2008-0007。廣東省實驗動物質(zhì)量監(jiān)測合格證為：監(jiān)證字2008A043號。以犬籠號及犬的耳號作雙重編號，犬籠號進(jìn)行插卡標(biāo)識。

1.1.2飼養(yǎng)條件：動物由取得實驗動物管理資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)管理。動物飼養(yǎng)于普通級動物房犬觀察室內(nèi)，通風(fēng)及光照良好，溫度為(16～26)℃, 濕度為40%～70%。監(jiān)測合格證號為監(jiān)證字號：2008C075，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0003。動物采用單籠飼養(yǎng)，飲水為經(jīng)過濾裝置后的自來水由動物自由攝??；飼料為定量喂食，成犬膨化顆粒飼養(yǎng)由廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院實驗動物研究開發(fā)中心提供，營養(yǎng)和衛(wèi)生符合GB14925-2001的要求。

1.2儀器設(shè)備

Sigma 3-18K冷凍臺式離心機(jī)(德國Sigma公司)、7020全自動生化分析儀(日本日立公司)、K/Na/Cl﹣分析儀(美國Medica公司)。

1.3試劑

血液生化質(zhì)控品與ALT、AST、ALP、TP、ALB、UREA、CREA、GLU、TCHO、TBIL、CK、GGT、CA、LDH、P、HDL-C、LDL-C、TG試劑盒由北京利德曼公司生產(chǎn)。K/Na/Cl﹣試劑包由美國Medica公司生產(chǎn)。

1.4方法

選取檢疫合格的普通級Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬靜脈血，加蓋于室溫靜置30 min～1 h,以2 000 r/min相對離心力20℃離心15 min，吸出血清在1 h內(nèi)檢測1次丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、總膽紅素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、鈣(CA)、乳酸脫氫酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、鈉(Na+)/鉀(K+)/氯(Cl-)；然后將血清分裝為3份，每份分裝為每個檢測時間1管：第1份放置在冰箱中(2～8)℃冷藏保存，在血清分離后2、5、8、12 h檢測上述指標(biāo)；第2份放置在冰盒(2～10)℃中保存并進(jìn)運輸過程，在血清分離后2、5、8 h檢測上述指標(biāo)；第3份放置在冰箱-20℃冷凍保存，第3份血清在冷凍后1、3、5 d檢測上述指標(biāo)。

表1　Bengle犬血清在2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內(nèi)結(jié)果比較

表2　Bengle犬血清在冰盒(2～10℃)中進(jìn)行運輸保存2、5、8h與血清分離后1h內(nèi)結(jié)果比較

Tab.3Detection results of the serum samples of Beagle dogs preserved in refrigerator at -20℃ for

冰箱-20℃保存Preservationinrefrigeratorat-20℃指標(biāo)Items1h內(nèi)Withinanhour1d1day3d3days5d5daysALT(U/L)36.67±7.9936.50±7.7737.17±8.5937.83±7.49AST(U/L)28.33±5.4327.50±4.8527.67±4.2327.83±4.36ALP(U/L)88.00±18.1988.00±19.2284.00±17.2984.83±16.68TP(g/L)66.25±4.4467.13±5.1266.30±3.5567.40±4.68ALB(g/L)26.65±1.5826.98±1.3226.43±1.6926.43±1.79UREA(mol/L)6.30±0.586.31±0.646.31±0.606.43±0.60CREA(umol/L)79.43±6.3377.18±6.2178.77±4.1680.95±8.47GLU(mmol/L)5.56±0.235.52±0.195.47±0.235.40±0.31TCHO(mmol/L)4.18±0.504.71±1.034.15±0.494.24±0.48TBIL(μmol/L)1.08±0.400.98±0.420.97±0.481.03±0.45CK(U/L)128.67±31.33134.50±34.48132.50±33.97135.33±33.18GGT(U/L)3.17±1.473.33±1.033.67±1.033.33±0.82CA(mmol/L)2.75±0.092.75±0.112.75±0.122.76±0.10LDH(U/L)16.17±1.4717.67±2.8818.17±2.9323.00±7.35變動百分率為41%P(mmol/L)1.71±0.151.72±0.151.73±0.171.75±0.18HDL-C(mmol/L)4.34±0.564.38±0.534.27±0.503.77±0.48LDL-C(mmol/L)0.10±0.020.10±0.020.11±0.020.13±0.03*變動百分率為39%TG(mmol/L)0.48±0.090.49±0.090.50±0.100.52±0.09Na+(mmol/L)148.47±5.56148.10±5.21151.92±7.90148.85±5.59K+(mmol/L)4.50±0.154.51±0.124.58±0.204.47±0.18Cl-(mmol/L)116.82±2.35116.98±2.91120.98±5.28116.25±3.26

注：與1 h檢測結(jié)果比較，*(P<0.05)，變動百分率計算公式：(d5- h1)/h1*100%

Note: Compared with 1 hour test results,*(P<0.05)，Percentage change formula: (d5- h1)/h1*100%

2結(jié)果

2.1Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內(nèi)結(jié)果比較

結(jié)果見表1，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.2Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中進(jìn)行運輸保存2、5、8 h與血清分離后1 h內(nèi)結(jié)果比較

結(jié)果見表2，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.3Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d的結(jié)果與血清分離后1h內(nèi)檢測結(jié)果比較

除保存5 d的LDL-C差異有顯著性(P<0.05)外，均差異無顯著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；而LDH的變動百分率為41%，LDL-C的變動百分率為39%(表3)。

3討論

Beagle犬為新藥安全性評價的常用動物，血液生化指標(biāo)為長期毒性試驗的常規(guī)檢測指標(biāo)，在藥物非臨床研究工作中對血液生化指標(biāo)的檢測和分析至關(guān)重要，在評價藥物對肝腎功能的影響時是通過各種生化實驗方法監(jiān)測與肝臟、腎臟功能代謝有關(guān)的各項指標(biāo)，以反映肝腎的功能基本狀況[8]。血液生化檢測能為藥物安全性評價實驗和臨床用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，所以在檢測血液生化時，為了得到更加準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)，應(yīng)控制好樣本的檢測時間和樣本保存條件。已有的文獻(xiàn)報道[9]，Beagle犬血清在4℃存放24 h和48 h后的結(jié)果顯示各項生化指標(biāo)與放置前無明顯差異，提示不經(jīng)凍融，4℃保存相對較短時間(如48 h內(nèi))更能反映血液生化的“真值”。

本實驗室通過Beagle犬血液標(biāo)本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測的比對實驗，結(jié)果顯示Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內(nèi)結(jié)果比較，差異均無顯著性(P>0.05)，與文獻(xiàn)報道[9]的結(jié)果一致。

此外本實驗還進(jìn)行了Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中進(jìn)行運輸保存2、5、8h與血清分離后1h內(nèi)結(jié)果比較，運輸過程采用專用空調(diào)運輸車，并用水銀溫度計記錄冰盒內(nèi)溫度，結(jié)果差異均無顯著性(P>0.05)，提示在冰盒(2～10℃)環(huán)境下進(jìn)行運輸8 h對血液生化檢測結(jié)果無明顯影響。

實驗還進(jìn)行了Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d與血清分離后1h內(nèi)結(jié)果比較，結(jié)果冰箱-20℃保存5d的LDL-C有顯著性差異(P<0.05)，其他結(jié)果差異均無顯著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；冰箱-20℃保存5 d的LDH與1h內(nèi)的數(shù)據(jù)變動百分率達(dá)41%，可能是隨著存放時間增長而出現(xiàn)數(shù)據(jù)波動大導(dǎo)致其標(biāo)準(zhǔn)差變大，而且LDL-C的變動百分率為39%，也出現(xiàn)較大的波動。所以，建議保存于-20℃環(huán)境的Beagle犬血清最好在3d內(nèi)進(jìn)行檢測。

綜上所述，根據(jù)Beagle犬血液標(biāo)本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果的影響的試驗結(jié)果，在進(jìn)行Beagle犬血樣采集后，應(yīng)及時制備、分離血清并在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測，如未能在樣本制備后1 h內(nèi)檢測，應(yīng)將樣本置于(2～8)℃環(huán)境并在12 h內(nèi)進(jìn)行檢測，或置于約-20℃環(huán)境并在3 d內(nèi)進(jìn)行檢測。如要對血清標(biāo)本進(jìn)行運輸，應(yīng)放置于冰盒(2～10)℃中，并在8 h內(nèi)進(jìn)行檢測。該試驗研究旨在為藥物非臨床評價中心實行多場所管理[10]和外單位或異地送檢血液標(biāo)本時提供參考，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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〔修回日期〕2015-07-02

研究報告

Influence of different preservation conditions and times on the

measurement of blood biochemical indicators in Beagle dogs

YU Zeng-cai, CHEN Jie-jun, SUN Jing-jing, GUO Qiu-ping

(Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangzhou General Pharmaceutical

Research Institute Co., Ltd，Guangzhou 510240, China)

【Abstract】ObjectiveBeagle dogs are commonly used animal for drug safety evaluation. As the necessary parameters, blood biochemical indicators are detected in acute or chronic toxicity tests. This study aims at assessing the influence of different preservation conditions and different preservation time on blood biochemical indicators to ensure the reliability of test results of long-term toxicity assessment.MethodsSix Beagle dogs (3 males and 3 females) were used in this study. After collection and preparation of serum samples, biochemical indicators were detected after preservation in refrigerator at 2-8℃ for 1, 2, 5, 8, and 12 hours; after preservation in ice transportation boxes at 2-10℃ for 2, 5, and 8 hours; and after preservation in refrigerator at -20℃ for 1, 3, and 5 days. The biochemical indicators included alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (propagated), urea, creatinine (CREA), glucose (GLU), total cholesterol (TCHO), total bilirubin (TBIL), creatine kinase (CK), gamma pancreatic acyl transferase (GGT), calcium (CA), lactate dehydrogenase (LDH), phosphorus (P), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), triglyceride (TG), sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-). ResultsCompared with the results of samples preserved for 1 hour, the LDL-C result of that preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was significantly increased (P<0.05), and the coefficient of variation was 39%. The CK and LDH results of specimens preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was increased but not significantly (P>0.05), and the coefficient of variation of LDH was 41%. ConclusionsAccording to the test results of blood biochemical indicators in the Beagle dogs detected after different preservation conditions and different preservation time in this study, detection test should be done within 1 hour, if not, detection should be done within 12 hours for the samples preserved at 2～8℃, or within 3 days for the sample preserved at -20℃. For transportation of serum samples, the serum samples should be placed in the ice box at 2～10℃, and detection test should be done within 8 hours.

【Key words】Beagle dogs; Preservation conditions; Preservation time; Blood biochemical indicators

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.004

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0018-05

[通訊作者]郭秋平(1978-)，女，高級工程師，博士，從事新藥研發(fā)。13427595023@163.com。

[作者簡介]余增才(1985-)，男，助理工程師，本科，從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗。yzc6409634@163.com。

[基金項目]廣州市科信局生物產(chǎn)業(yè)重大專項(編號：201300000052)；廣州市海珠區(qū)科技計劃項目(編號：2012-CG-01)。