新生血管動(dòng)物模型的構(gòu)建

郭 婷，宋洪元，趙世紅

(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院眼科，上海 200433)

新生血管是指從已有毛細(xì)血管發(fā)展形成新血管，該過程受血管生成因子和血管抑制因子雙重調(diào)控，是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程[1]。這個(gè)過程有利于胚胎發(fā)育、傷口修復(fù)以及缺血組織再灌注等[2]。然而對(duì)于腫瘤、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)等疾病，新生血管卻會(huì)造成身體嚴(yán)重?fù)p害[3-6]。它們產(chǎn)生新生血管的原因有各自的機(jī)制，目前還尚不明確。為了深入探討這些疾病的發(fā)病機(jī)制，建立成熟和接近臨床的新生血管動(dòng)物模型是必要前提，本文對(duì)建立新生血管動(dòng)物模型的4種常用方法進(jìn)行了綜述。

1 主動(dòng)脈環(huán)血管生成模型

1990年，Nicosia和Ottinetti首次設(shè)計(jì)了大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管生成模型(aortic ring assay,ARA)[7]。這種方法目前應(yīng)用較廣，所選用的動(dòng)物主要有大鼠、小鼠、豬等[8]。

1.1 方法

分離8～12周野生型C57 BL/6小鼠胸主動(dòng)脈，于Opti-MEM培養(yǎng)基中清洗，剝離干凈殘帶組織后切成寬為0.5～1.0 mm的環(huán)，Opti-MEM饑餓過夜，第2天將環(huán)置于鋪有基質(zhì)膠的96孔板中培養(yǎng)，觀察主動(dòng)脈形成新生血管的情況[9]。本模型能檢測(cè)生長因子和一些小分子藥物對(duì)新生血管形成的影響。

1.2 影響因素

1.2.1 培養(yǎng)基 主動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)采用Opti-MEM培養(yǎng)基加2.5%的胎牛血清,相比DMEM加2.5%的胎牛血清培養(yǎng)基，主動(dòng)脈環(huán)在Opti-MEM培養(yǎng)基中出芽效果更明顯[9]。

1.2.2 基質(zhì)和生長因子 培養(yǎng)主動(dòng)脈環(huán)的基質(zhì)主要有膠原基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、基底膜基質(zhì)[10,11]。生長因子有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。在纖維蛋白基質(zhì)中加入bFGF,或在膠原基質(zhì)中加入VEGF，新生血管出芽效果較明顯，基底膜基質(zhì)添加10%的胎牛血清而不添加任何生長因子是最優(yōu)組合[9]。

1.3 其他

該模型是一種與人體生理學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可形成類似于人體的血管，很好地模擬體內(nèi)新生血管形成；實(shí)驗(yàn)成本低、周期短，可獲取大量樣本，方便、經(jīng)濟(jì)和快捷；還可進(jìn)行多種處理，如藥物處理、基因干擾或過表達(dá)等[10]。模型的不足是與樣本相關(guān)，如組織的新鮮度、非主動(dòng)脈組織的摻雜、缺乏流動(dòng)性等都會(huì)對(duì)模型產(chǎn)生影響[12]。

2 基質(zhì)膠栓動(dòng)物模型

基質(zhì)膠栓動(dòng)物模型(matrigel plug assay,MPA)是通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新生血管形成能力的方法[13]。此模型因其低成本、高效率、可操控性強(qiáng)、結(jié)果可信及可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為目前眾多實(shí)驗(yàn)室的新選擇[14]。

2.1 方法

取10～14周齡小鼠于腹部皮下注射基質(zhì)膠500 μl，待凝固(0.5 h)后在同一部位做一個(gè)0.5 cm切口，在凝固的基質(zhì)膠栓子上做同樣的切口，將一塊預(yù)先包有檢測(cè)材料、大小為3.0 mm×2.0 mm×1.5 mm的無菌紗布敷料放入到栓子中心，縫合傷口，24 h內(nèi)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)傷口變化。bFGF誘導(dǎo)的新生血管在術(shù)后1周進(jìn)行檢測(cè)分析，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管則在術(shù)后1～2周進(jìn)行檢測(cè)分析[15]。檢測(cè)方法包括組織切片、熒光染色及測(cè)定栓子中的血紅蛋白[16]。本方法可模擬各類疾病新生血管形成，是一種可靠的檢測(cè)新生血管的動(dòng)物模型[17]

2.2 影響因素

生長因子bFGF和VEGF都能促進(jìn)新生血管的形成。bFGF對(duì)新生血管形成的影響具有劑量和時(shí)間依賴性；VEGF對(duì)新生血管形成的影響是劑量依賴型的[18]。

2.3 其他

目前采用的是改良后的MPA，相比傳統(tǒng)模型，實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，耗時(shí)長，但實(shí)驗(yàn)過程具有合理性和說服性，結(jié)果可靠[19]。

3 氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型

氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型(oxygen-induced retinopathy，OIR)是研究視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)疾病的常用動(dòng)物模型[20]。1994年Smith等[21]首次用小鼠成功構(gòu)建了該模型，它是目前最常用的動(dòng)物模型,研究人員認(rèn)為通過高氧誘導(dǎo)的小鼠RNV與人ROP病程相似。

3.1 方法

生后7 d的C57BL/6小鼠放入體積分?jǐn)?shù)為75%高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d，之后放入正常環(huán)境中飼養(yǎng)5 d即可成模[21]。小鼠經(jīng)高氧刺激再回到正常的氧環(huán)境后，其視網(wǎng)膜組織相對(duì)缺氧，VEGF分泌增多形成RNV[1]。通過視網(wǎng)膜熒光造影鋪片和計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞核進(jìn)入玻璃體的數(shù)量來檢測(cè)模型的成模情況[22,23]。該方法簡單、快捷、穩(wěn)定、成模率高、周期性短、重復(fù)性強(qiáng)，主要用來模擬ROP和DR[24]。

3.2 影響因素

3.2.1 動(dòng)物 大鼠、犬、貓和小鼠RNV模型都有報(bào)道[25]。目前，模型多選擇SD大鼠、C57BL小鼠等嚙齒類動(dòng)物，因它們的視網(wǎng)膜血管發(fā)育與人類相似[21]。大鼠雖生長快、繁殖性能好、存活率高、耐高氧能力強(qiáng)及眼球體積相對(duì)大，但建模成功率明顯不如C57BL小鼠高[26]。

3.2.2 周齡 1周齡小鼠的玻璃體動(dòng)脈退化程度最高，視網(wǎng)膜血管發(fā)育尚未成熟，當(dāng)缺氧刺激后所出現(xiàn)的血管增生性反應(yīng)主要為異常的視網(wǎng)膜血管，可最大限度地反映病理性視網(wǎng)膜血管新生的程度[27]。

3.2.3 時(shí)間 母鼠的存活是關(guān)系到建模小鼠能否健康成長的關(guān)鍵因素，母鼠的死亡直接導(dǎo)致動(dòng)物模型制備的失敗。研究發(fā)現(xiàn)，母鼠的耐氧能力要弱于新鼠，不能在高氧環(huán)境中存活>5 d[21]。

3.2.4 氧濃度 過低氧濃度不利于新生血管形成，>80%的氧濃度雖能促進(jìn)小鼠RNV形成，但是降低了母鼠和小鼠的存活率。研究發(fā)現(xiàn)75%的氧濃度既能保證小鼠RNV形成，又可最大程度地保證母鼠及小鼠的存活率[28]。

3.3 其他

OIR模型的實(shí)際建模過程中仍存在母鼠死亡率高、乳鼠成模率低且不穩(wěn)定等問題。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟，改進(jìn)方法也不斷出現(xiàn)。如母鼠固定間隔時(shí)間段哺乳幼鼠或多只母鼠交替哺乳小鼠，固定時(shí)間段開倉清洗和換食，釋放氧流量等可降低幼鼠的死亡率。

4 激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是脈絡(luò)膜的毛細(xì)血管增殖，通過布魯赫膜(Bruch’membrane)裂口在Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)之間或神經(jīng)視網(wǎng)膜與RPE之間，或RPE與脈絡(luò)膜之間增殖。

4.1 方法

激光誘導(dǎo)CNV模型是常用的CNV動(dòng)物模型，1979年，Ryan首次用小鼠建立了CNV模型，具體方法是將小鼠瞳孔散大，角膜表面放置蓋玻片，利用氬激光在脈絡(luò)膜數(shù)個(gè)點(diǎn)擊穿Bruch膜形成CNV，通過熒光標(biāo)記的葡聚糖血管灌注脈絡(luò)膜鋪片觀察CNV的情況[29]。本模型建模的機(jī)制雖與年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration，AMD)發(fā)生機(jī)制不完全相同，但是目前研究AMD引起的CNV最常用的模型。

4.2 影響因素

4.2.1 動(dòng)物 模型動(dòng)物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：病理學(xué)特征與人類CNV相似、模型持久、制模成功率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、模型眼與人眼盡可能接近，以及便于操作和觀察。激光誘導(dǎo)鼠CNV模型因其成本低、繁殖周期短、成模率高等優(yōu)點(diǎn)在臨床動(dòng)物模型中廣泛應(yīng)用[30]。靈長類動(dòng)物如猴等因價(jià)格貴、倫理審核困難等因素限制了其在前期研究的大批量應(yīng)用[31]。豬繁殖周期長，常被用于長期的藥物實(shí)驗(yàn)[32]。兔眼CNV模型費(fèi)用低、CNV發(fā)生率高、接近人眼球大小，應(yīng)用也較廣泛[33]。

4.2.2 常用激光 常用激光有氬激光、氪激光，不同激光波長不同，穿透力也不同，對(duì)視網(wǎng)膜損傷的程度也不同[34]。藍(lán)綠氬激光因穿透力弱，主要作用于視網(wǎng)膜的內(nèi)層和RPE層，Ryan建立的小鼠CNV模型就是用氬激光在眼底進(jìn)行激光光凝(647 nm,100 μm,50～100 mw,0.1 s)[29]。氪激光則作用于RPE和脈絡(luò)膜內(nèi)層，Ryan隨后應(yīng)用氪激光(488 nm和514nm，50～200 μm,200～950 mw,0.1～0.5 s)作用于猴視網(wǎng)膜建立了CNV模型[35]。

4.3 其他

激光誘導(dǎo)CNV模型并不是最理想的CNV動(dòng)物模型，它的機(jī)制是破壞RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體產(chǎn)生新生血管[36]，但是整個(gè)過程會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)同時(shí)參與病理性新生血管的形成，這與非炎癥反應(yīng)AMD的發(fā)生過程并不完全吻合，因此建模過程中需通過類固醇抑制炎癥反應(yīng)[37]。攜帶VEGF基因的腺病毒經(jīng)視網(wǎng)膜注射誘導(dǎo)CNV，雖可避免產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、基因持續(xù)時(shí)間短，也限制了其在CNV建模中的應(yīng)用[38]。

綜上所述，為了明確各種新生血管的發(fā)病機(jī)制，實(shí)驗(yàn)階段建立合理、適宜、方便、可控、發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型非常必要。ARA和MPA模型可檢測(cè)各種新生血管,OIR動(dòng)物模型是常用的RNV模型，激光誘導(dǎo)CNV動(dòng)物模型是常用的CNV動(dòng)物模型。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，研究人員應(yīng)該能研究出更符合新生血管發(fā)病機(jī)制、重復(fù)率更高、結(jié)果更可靠、更經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模型。

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