HPLC法測定天仙子東莨菪堿和莨菪堿的含量

HPLC法測定天仙子東莨菪堿和莨菪堿的含量

李巖1， 孟慶勇1， 趙欣1， 孫婷1， 李曉靜1,2， 程雪梅2， 王長虹2

(1新疆醫(yī)科大學藥學院藥劑物化教研室， 烏魯木齊830011；2上海中醫(yī)藥大學中藥研究所；中藥標準化教育部重點實驗室；

中藥新資源與質量標準綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室; 上海市復方中藥重點實驗室， 上海201210)

摘要：目的建立天仙子藥材中東莨菪堿和莨菪堿的高效液相測定方法。方法采用Symmetrix ODS-H色譜柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸水(14∶86)為流動相，檢測波長210 nm，流速1.0 mL/min，測定天仙子藥材中東莨菪堿和莨菪堿的含量。結果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的線性范圍分別為4.02～513.64 μg/mL (r=0.999 9)和4.00～512.00 μg/mL (r=0.999 8)，平均回收率分別為98.41%和98.79%。結論HPLC法測定準確、可控，能快速、簡便地控制天仙子藥材的質量。

關鍵詞：天仙子； 莨菪堿； 東莨菪堿； 高效液相色譜法

中圖分類號：R917文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.016

[收稿日期：2014-9-12]

基金項目：國家自然科學基金(81160137)；新疆維吾爾自治區(qū)教育廳青年教師科研培育基金(XJEDU2011S23)

作者簡介：李莉(1987-)，女，在讀碩士，研究方向：微量元素與健康。

Determination of total alkaloids from Hyoscyami semen by HPLC

LI Yan1, MENG Qingyong1, ZHAO Xin1, SUN Ting1, LI Xiaojing1,2, CHENG Xuemei2, WANG Changhong2

(1DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011China；2InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditional

ChineseMedicine;TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicinesand

TheSATCMKeyLaboratoryforNewResourcesandQualityEvaluationofChineseMedicines;

ShanghaiKeyLaboratoryofTCMComplexPrescription,Shanghai201210,China)

Abstract:ObjectiveTo establish quality control methods for determining active ingredients of the total alkaloids from Hyoscyami semen. MethodsThe determination of scopolamine and hyoscyamine in H. semen was performed on Symmetrix ODS-H column and mobile phase consisted of acetonitrile -0.1% trifluoroacetic acid (14∶86). The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detective wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear ranges of scopolamine and hyoscyamine were 4.02-513.64 μg/mL (r=0.999 9) and 4.00-512.00 μg/mL (r=0.999 8), and the average recoveries were 98.41% and 98.79% respectively. ConclusionThe method could be easily used to evaluate the quality of H. semen, quick, accurate and controllable.

Key words：Hyoscyamisemen; hyoscyamine; scopolamine; HPLC

天仙子為茄科(Solanaceae)植物莨菪(Hyoscyamus niger L.)的干燥成熟種子，最早收載于《神農本草經(jīng)》。天仙子性溫，味苦辛，有毒，具有定癇、止痛的功效，常用于治療癲狂、風痹厥痛、惡瘡等癥[1]。國內外學者已從天仙子的莖葉及種子中分離出近百種化合物，包括生物堿類、多糖類、黃酮類、香豆素類、木脂素酰胺類、甾族皂甙類等化合物[2-7]。其中托烷類生物堿(主要為莨菪堿和東莨菪堿)被認為是天仙子發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)作用相關疾病的有效成分。目前的研究中有關天仙子的定量測定以HPLC法為主，2010年版《中華人民共和國藥典》中，HPLC法測定天仙子藥材中阿托品和東莨菪堿含量的色譜條件中流動相組成極其復雜。本研究采用以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)為流動相，對東莨菪堿和阿托品的分離效果良好，以此建立了更為簡易的HPLC含量測定方法，為藥材的質量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀(Waters Co.)，DKZ-2系列電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司)，MDF1-100手提式中藥粉碎機(上海民德機械制造有限公司)，N-1001 旋轉蒸發(fā)儀，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，5415R離心機 (Eppendorf，德國)， BS/BT電子天平( 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，分析色譜柱Symmetrix ODS-H(4.6 mm×250 mm，5μm)，超純水器( Millipore公司)。

天仙子(批號：20120510-1、20120510-2、20120510-3，安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司提供，產地：新疆)，由吳立宏副研究員(上海中藥標準化研究中心)鑒定為茄科植物天仙子的(Hyoscyamus niger L.)的干燥種子；氫溴酸東莨菪堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100050-200309)，硫酸阿托品(Sigma-Aldrich，批號：077K1047)，乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher)，甲醇 (色譜純，F(xiàn)isher)，乙醇為工業(yè)級，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1對照品溶液的制備分別精密稱取氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對照25.08、25.00 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得含氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對照品濃度分別為1.003和1.000 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.2供試品溶液的制備參照2010版《中華人民共和國藥典》[8]測定天仙子藥材的含量測定方法，制備天仙子的供試品溶液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗色譜柱Symmetrix ODS-H (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相:乙腈-0.1%三氟乙酸 (14∶86)；檢測波長λ為210 nm；流速:1.0 mL/min；柱溫: 30℃；進樣量:20 μL。在此條件下，氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品與樣品中其他成分達到基線分離(圖1)。

2.4線性關系的考察精密量取“2.1”項下混合標準品儲備液0.04、0.06、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mL,分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20 μL注入色譜儀進行測定并記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸。氫溴酸東莨菪堿的線性回歸方程為: Y=20 570X+20 934，r=0.999 9(n=8)；硫酸阿托品的線性回歸方程為: Y=23 612X+59 928，r=0.999 7(n=8)。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品分別在4.02～513.64 μg/mL和4.00～512.00 μg/mL范圍內與色譜峰面積有良好的線性關系。

1：氫溴酸東莨菪堿；2：硫酸阿托品

2.5最低檢測限將混合對照品儲備液按逐步稀釋法稀釋，信噪比約為3∶1時，氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的最低檢測限分別為2.5 μg/mL和2.0 μg/mL。

2.6穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h測定，計算氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的含量及RSD%，結果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的RSD%分別為1.41% 和1.61%。

2.7精密度試驗精密吸取混合對照品儲備液0.5、1.0、2.0 mL分別置于10 mL量瓶中，純化水定容。于1 d內測定5次,計算日內精密度RSD(%)；連續(xù)測定3 d，進行日間精密度測試，結果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的日內、日間精密度RSD均<2.0%，說明日內、日間精密度良好。

2.8重復性試驗取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，計算東莨菪堿、莨菪堿的含量(注：東莨菪堿含量=氫溴酸東莨菪堿含量×0.789;莨菪堿含量=硫酸阿托品的含量×0.855)及RSD(%)，結果東莨菪堿、莨菪堿的RSD分別為1.40%、1.51%，表明方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗取已測定準確含量的天仙子藥材粉末約1.0 g，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入各對照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法處理，測定，計算加樣回收率，結果見表1。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的高、中、低3個濃度的加樣回收率均在98%～120%范圍內，RSD<2.0%。

表1　回收率測定結果( ±s)

表1　回收率測定結果( ±s)

加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%氫溴酸東莨菪堿102.72232.2697.73±2.00128.41252.6898.74±2.2398.41±1.891.92154.09284.0998.76±1.96硫酸阿托品171.52386.2999.64±2.29215.04427.3798.57±2.2398.79±1.971.99256.00466.7398.15±1.89

2.10樣品含量測定將3批天仙子藥材按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進樣20 μL測定，記錄各個峰面積，分別計算天仙子中莨菪堿和東莨菪堿的含量，結果見表2。3批天仙子藥材中東莨菪堿的含量在0.01%左右，莨菪堿的含量在0.02%左右。

表2　樣品含量測定結果( ±s)

表2　樣品含量測定結果( ±s)

成分批號樣品含量/%RSD/%20120510-10.0104±0.00021.92氫溴酸東莨菪堿20120510-20.0101±0.00021.9820120510-30.0103±0.00032.9120120510-10.0184±0.00021.09硫酸阿托品20120510-20.0171±0.00021.1720120510-30.0199±0.00021.00

3討論

目前有關托烷類生物堿的含量測定方法主要有紫外分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、離子對色譜發(fā)法[12]、HPLC法[13]等。對天仙子藥材中托烷類生物堿的含量測定方法多以《中華人民共和國藥典》中HPLC測定方法為主，2010年版《中華人民共和國藥典》中HPLC法測定天仙子藥材中阿托品和東莨菪堿含量的色譜條件為：甲醇-乙腈-30 mmol/L醋酸鈉緩沖液(含0.02%三乙胺、0.3% 四氫呋喃，用冰醋酸調pH值至6.0) (10∶5∶85)，其流動相組成極其復雜。本研究嘗試了不同的流動相組成，發(fā)現(xiàn)阿托品和東莨菪堿對酸性流動相比較敏感，其中以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)為流動相，對東莨菪堿和阿托品的分離效果良好，以此建立了更為簡易的HPLC含測方法。

托烷類生物堿也存在于洋金花和曼陀羅等植物中，并不是天仙子藥材中的專屬指標成分。因此，今后應該尋找天仙子中更專屬的活性成分作為質控的指標，以提高和完善《中華人民共和國藥典》的質量標準。

本實驗對3批不同來源的天仙子藥材中托烷類生物堿(莨菪堿和東莨菪堿合計)的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)其含量較低，僅為0.03%左右，原因有待進一步研究。但目前結果提示今后可從生產環(huán)節(jié)和資源建設著手，響應醫(yī)藥工業(yè)“十二五”規(guī)劃對藥材原料規(guī)范化、規(guī)?；⒓s化的要求，逐步提高藥材的品質。

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(本文編輯施洋)

通信作者：楊曉燕，女，教授，博士生導師，研究方向：微量元素與健康，E-mail：390068143@qq.com。

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