3-羥基-28-羧基熊果酸衍生物的合成及抗腫瘤活性研究

張良鋒， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

熊果酸(ursolic acid，UA)又名烏索酸，是從枇杷葉、女貞葉和夏枯草等天然植物中分離得到的一種具有烏蘇烷型骨架的五環(huán)三萜類天然產(chǎn)物[1-2].研究表明，熊果酸具有多種重要的生物活性，如：鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗癌、抗?jié)?、抗病毒、降低血糖、抗瘧等作用[2-3].MA C M等[4]將熊果酸C-3位羥基烷?；-11位氧化和C-28位羧基成酯，得到3-烷酰氧基-11-氧代-28-羧酸酯類熊果酸衍生物，具有很強的抗腫瘤活性.白育軍等[5]將熊果酸C-3位氧化、C-28位羧基成酯得到熊果酸衍生物，具有很強的體外抗腫瘤活性.Gayathri C等[6]將熊果酸C-2位引入吸電子基團，如：I、CN和CF3，C-28位羧基成酰胺，得到的熊果酸衍生物具有很強的抗腫瘤作用.在五環(huán)三萜類化合物結構修飾的過程中，對羧基的修飾主要為羧基成酯和成酰胺的反應[7-10].本文以熊果酸(UA)為先導化合物，在本課題組前期對五環(huán)三萜類化合物結構改造以及構效關系研究的基礎上[11-15]，保留五環(huán)三萜骨架，對其C-3和C-28位進行結構修飾，合成了11個新的熊果酸衍生物，并對化合物進行了體外抗腫瘤活性的研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Büchi B-540熔點測定儀；BrukerARX-500型核磁共振分析儀，CDCl3為溶劑，TMS為內標；熱電-菲尼根LCQ型質譜儀；EA3000有機元素分析儀；Büchi R-200旋轉蒸發(fā)儀；SHZ-2000型雙配套循環(huán)水式多用真空泵；SANYO MC0175型CO2培養(yǎng)箱；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺；Olympus IX70倒置顯微鏡；BIO-RAD MODEL680型酶標儀；DL92125-125MM游標卡尺.

薄層色譜硅膠GF254，顯色劑為體積分數(shù)為10 %的硫酸乙醇溶液；活性測試所用的培養(yǎng)基為RPMI-1640(含質量分數(shù)為10 %的胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，質量濃度為100 mg·L-1的鏈霉素)；溴化四氮唑鹽(MTT)、蛋白酶K(Proteinase K)和小牛血清蛋白(BSA)；HeLa細胞、HepG2細胞和BGC-823細胞由中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所藥理室提供.所有試劑均為分析純或化學純.

1.2 目標化合物的合成路線

目標化合物的合成路線如圖1 所示.

反應條件：a.DCC,DMAP,THF; b.(COCl)2，CH2Cl2; c.amines,CH2Cl2,rt; d.Jone′s reagent; e.NH2OH·HCl,Py;

f.Ac2O,Py,DMAP or EtBr,KOH,DMF; g.(COCl)2，CH2Cl2; h.amines or alcohol or phenol,CH2Cl2,rt

圖1 目標化合物的合成路線

Fig.1 Synthetic routes of target compounds

1.3 中間體的合成

3-氧代熊果酸(UA-1)：參照文獻[1]的方法，制備化合物3-氧代熊果酸(UA-1)，得白色固體35.4 mg，收率70.9 %.

3-肟基熊果酸(UA-2)：將UA-1(50.0 mg，0.11 mmol)溶于適量吡啶中，加入鹽酸羥胺(100 mg，1.44 mmol)，115 ℃下回流1.5 h，反應完畢后倒入冰水中，產(chǎn)生大量白色沉淀，抽濾，水洗濾餅至中性，得白色固體42.8 mg，收率為83.0 %.

3-乙酰氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酸(UA-3a)：將UA-2(50.0 mg，0.11 mmol)溶于5 mL四氫呋喃溶液中，依次加入0.3 mL吡啶、乙酸酐(337 mg，3.30 mmol)和少量DMAP，室溫下攪拌，TLC檢測反應終點(展開劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，顯色劑為體積分數(shù)10 % 的硫酸乙醇溶液)，反應完畢，減壓蒸除溶劑，加入3 mL水，用濃度為2 mol·L-1的鹽酸調pH值至3～4，抽濾，濾餅水洗至中性，室溫自然干燥，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1，得白色固體40.2 mg，產(chǎn)率為73.8 %，m.p. 87.5～91.4 ℃.

3-乙氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酸(UA-3b)：將UA-2(50.0 mg，0.11 mmol)溶于5 mL DMF中，依次加入1 mL溴乙烷和氫氧化鉀(50.0 mg，0.89 mmol)，70 ℃下攪拌1 h，TLC檢測反應終點(展開劑：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，顯色劑為體積分數(shù)10 %的硫酸乙醇溶液)，加入適量二氯甲烷稀釋，用濃度為2 mol·L-1的鹽酸洗滌2次，飽和氯化鈉水洗至中性，合并有機相，干燥，濃縮，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1，得白色固體36.2 mg，產(chǎn)率為68.4 %，m.p. 155.5～157.4 ℃.

3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸(UA-4)：參照文獻[1]的方法，制備化合物3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸(UA-4)，得白色固體92.9 mg，產(chǎn)率80.2 %，m.p. 183.6～184.7 ℃.

1.4 目標化合物的合成

N-[3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-2-氨基乙醇(Ⅰ1)：將化合物UA-4(80.0 mg，0.15 mmol)溶于5 mL二氯甲烷中，緩慢滴加1 mL草酰氯，室溫攪拌24 h，減壓蒸除溶劑，加入3 mL環(huán)己烷，溶液呈渾濁狀態(tài)，蒸干溶劑，重復該操作3次，得到化合物UA-5.將化合物UA-5溶于3 mL二氯甲烷中，加三乙胺調pH為9～10，攪拌5 min后加入2-氨基乙醇(37.1 mg，0.61 mmol)，室溫攪拌，TLC檢測反應終點.反應完畢，向反應液中加入3 mL水，用濃度為2 mol·L-1的鹽酸調pH至3，析出白色固體，抽濾，水洗濾餅至中性，室溫干燥，粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(丙酮)=5/1，得白色粉末狀固體59.3 mg，產(chǎn)率70.3 %，m.p. 104.7～106.5 ℃.

N-[3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-2-氨基-1-丙醇(Ⅰ2)：按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物UA-4(80.0 mg，0.15 mmol)與2-氨基-1-丙醇(45.6 mg，0.61 mmol)反應，所得粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(丙酮)=3/1，得白色粉末狀固體44.0 mg，產(chǎn)率50.8 %，m.p. 210.5～212.8 ℃.

N-[3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-3-氨基丙醇(Ⅰ3)：按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物UA-4(80.0 mg，0.15 mmol)與3-氨基-1-丙醇(45.6 mg，0.61 mmol)反應，所得粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(丙酮)=3/1，得白色粉末狀固體36.3 mg，產(chǎn)率42.0 %，m.p. 210.7～212.3 ℃.

N-[3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-4′-甲基哌嗪(Ⅰ4)：按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物UA-4(80.0 mg，0.15 mmol)與N-甲基哌嗪(60.9 mg,0.68 mmol)反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(丙酮)=3/1，得白色粉末狀固體55.7 mg，產(chǎn)率60.2 %，m.p. 82.6～84.3 ℃.

N-[3β-丁酰氧基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-環(huán)己胺(Ⅰ5)：按照化合物Ⅰ1的合成方法，由化合物UA-4(80.0 mg，0.15 mmol)與環(huán)己胺(60.3 mg,0.61 mmol)反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(丙酮)=10/1，得白色粉末狀固體62.3 mg，產(chǎn)率67.5 %，m.p. 115.3～117.5 ℃.

3-乙酰氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰-4′-硝基苯酚酯(Ⅱ1)：將化合物UA-3a(50.0 mg，0.10 mmol)溶于5 mL二氯甲烷中，緩慢滴加2 mL草酰氯，室溫攪拌20 h，減壓蒸除溶劑，加入3 mL環(huán)己烷，蒸干溶劑，重復該操作3次，得到3-乙酰氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰氯.將得到的酰氯溶于3 mL二氯甲烷中，加三乙胺調pH至 9 ～10，攪拌5 min后，加入對硝基苯酚(20.9 mg，0.15 mmol)，室溫攪拌，TLC檢測反應終點.減壓蒸除溶劑，加入2 mL水，用濃度為2 mol·L-1的鹽酸調pH至 3～4，析出白色固體，抽濾，水洗濾餅至中性.所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=15/1，得白色粉末狀固體24.5 mg，產(chǎn)率39.1 %，m.p. 104.2～106.1 ℃.

N-[3-乙酰氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-2-氨基乙醇(Ⅱ2)：按照化合物Ⅱ1的合成方法，由化合物UA-3a(50.0 mg，0.10 mmol)經(jīng)酰氯與2-氨基乙醇(35.0 mg，0.57 mmol)反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=8/1，得白色粉末狀固體18.7 mg，產(chǎn)率34.1 %，m.p. 90.7～91.3 ℃.

N-[3-乙酰氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-二丁胺(Ⅱ3)：按照化合物Ⅱ1的合成方法，由化合物UA-3a(50.0 mg，0.10 mmol)經(jīng)酰氯與3 mL二丁胺反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1，得白色粉末狀固體19.0 mg，產(chǎn)率31.8 %，m.p. 106.3～107.5 ℃.

N-[3-乙氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-苯胺(Ⅱ4)：按照化合物Ⅱ1的合成方法，由化合物UA-3b(50.0 mg，0.10 mmol)經(jīng)酰氯與2 mL苯胺反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1，得白色固體34.5 mg，產(chǎn)率為59.95 %，m.p. 142.5 ～144.3 ℃.

3-乙氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯(Ⅱ5)：將化合物UA-3b(50.0 mg，0.10 mmol)和無水碳酸鉀(30 mg，0.22 mmol)加到5 mL DMF中，然后加入2滴溴乙烷，室溫攪拌，TLC檢測反應終點.加入2 mL飽和食鹽水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，水洗至中性，濃縮，干燥，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=9/1，得白色粉末狀固體18.5 mg，產(chǎn)率35.2 %，m.p. 169.5～170.4 ℃.

N-[3-乙氧亞氨基-烏蘇烷型-12-烯-28-酰]-苯肼(Ⅱ6)：按照化合物Ⅱ1的合成方法，由化合物UA-3b(50.0 mg，0.10 mmol)經(jīng)酰氯與苯肼(16.2 mg，0.15 mmol)在室溫條件下反應，所得粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1，得白色粉末狀固體22.4 mg，產(chǎn)率38.1 %.m.p. 178.4～180.6 ℃.

1.5 初步體外細胞毒活性測試

以吉非替尼為陽性對照藥，采用MTT法對合成的目標化合物進行體外抗腫瘤活性測試.所選用的腫瘤細胞為人宮頸癌細胞(HeLa)、人肝癌細胞(HepG2)和人胃癌細胞(BGC-823).對數(shù)生長期腫瘤細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內，每孔100 μL(大約含4000個細胞)，置37 ℃、摩爾分數(shù)為5 %的CO2溫箱中培養(yǎng).培養(yǎng)24 h后，給藥組加入濃度為1×10-5mol·L-1的測試物，至少設3個平行孔，陰性對照組加入與給藥組等體積的溶劑，并設只加培養(yǎng)基的空白對照組，置37 ℃、摩爾分數(shù)為5 %的CO2溫箱中培養(yǎng).48 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(質量濃度為1 g·L-1)50 μL，在37 ℃下，孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜顆粒，輕度振蕩溶解.在酶標儀波長490 nm條件下測定各孔光密度值(OD)，計算所測化合物對細胞的抑制率和IC50值.試驗重復3次，結果取平均值.

抑制率=

2 結果與討論

2.1 化學合成

以熊果酸(UA)為起始原料，經(jīng)過?；?、酯化或酰胺化等反應得到11個目標化合物，目標化合物的結構經(jīng)1H-NMR、元素分析和MS確定，均為新化合物，數(shù)據(jù)見表1和表2.

表1 目標化合物的質譜和元素分析數(shù)據(jù)

注：括號內為計算值

表2 目標化合物的氫譜數(shù)據(jù)

2.2 抗腫瘤活性測試

以吉非替尼為陽性對照藥，采用MTT法測試目標化合物體外抗腫瘤活性，活性數(shù)據(jù)見表3.結果表明：所測試的目標化合物對HeLa、HepG2和BGC-823三種細胞生長均具有一定的抑制作用，其中化合物Ⅱ4和Ⅱ6對三種腫瘤細胞均表現(xiàn)出很強的抑制活性.化合物Ⅱ4對HeLa、HepG2和BGC-823細胞的抑制率分別為50.3 %、59.8 %和62.1 %，明顯高于臨床常用藥物吉非替尼.化合物Ⅱ6對HeLa、HepG2和BGC-823細胞的抑制率分別為44.7 %、45.0 %和50.1 %，明顯高于母體化合物UA，與吉非替尼相當.可以看出：C-3位羥基氧化后成肟，引入烷氧亞氨基，同時在C-28位引入酰胺基團可以提高其抗腫瘤活性.化合物Ⅱ4和Ⅱ6對三種腫瘤細胞的抑制活性明顯高于Ⅰ1和Ⅱ3等化合物.所以，C-28位羧基所連接胺的結構對抑制活性可能有較大的影響.

表3 目標化合物對HeLa、HepG2和BGC-823腫瘤細胞增殖的抑制活性

注：化合物濃度為1×10-5mol·L-1，經(jīng)過72 h處理后的細胞抑制率； nt:not tested.

3 結束語

初步的藥理實驗結果表明：C-3位引入烷氧亞氨基(或羥基成酯)，C-28位羧基成酯或酰胺，對其體外抗腫瘤活性具有提高作用.可見，合理的修飾熊果酸C-3位羥基、C-28位羧基，對熊果酸抗腫瘤活性有較大影響.這對下一步的結構設計和優(yōu)化具有一定的指導意義，為今后研究和開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物打下良好的基礎.

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