CXCR4在乳腺癌組織芯片中的表達及其臨床意義

張楊　王成昆　+彭波　朱歡　張志杰

[摘要] 目的 檢測趨化因子受體4（CXC chemokinereceptortype4，CXCR4）在各種乳腺癌組織及相應正常乳腺組織中的表達并分析其臨床病理意義。 方法 組織芯片中標本收集于2010年5月—2014年9月，應用免疫組化法檢測組織芯片中204例乳腺癌組織和36例正常乳腺組織CXCR4蛋白的表達，以棕色顆粒為陽性標準計算染色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比進行半定量處理。結果 CXCR4蛋白主要表達于細胞膜和細胞漿，在相應正常乳腺組織、小葉原位癌、導管內原位癌和浸潤性導管癌中的陽性表達率依次升高，分別為8.3%（3/36）、25.0%（1/4）、10.0%（5/50）、72.0%（108/150），4組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；在I、II和III級以上分級的乳腺癌組織中，CXCR4蛋白的陽性表達率分別為18.2%（2/11）、80.4%（78/97）、69.8%（30/43），3組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；CXCR4蛋白在有轉移的腫瘤組織和無轉移的乳腺癌組織中的陽性率分別為88.4%（61/69）和11.1%（15/135）。結論 CXCR4在部分乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌組織類型及乳腺癌組織侵襲轉移能力密切相關。

[關鍵詞] CXCR4；乳腺癌；組織芯片；免疫組織化學法

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）11（c）-0014-03

[Abstract] Objective To detect the expression of CXC chemokine receptor 4 （CXCR4） in various breast cancer tissues and normal breast tissues and analyze its clinical pathological significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of CXCR4 protein in 204 cases of breast cancer tissues and 36 cases of normal breast tissues in the tissue microarray samples collected from May 2010 to September 2014. Using brown granules as the positive standard， staining intensity and percentage of positive cells in the total cell number were calculated for semi-quantitative treatment. Results CXCR4 protein was mainly expressed in cell membrane and cytoplasm. The positive expression rate of CXCR4 in normal breast tissues， lobular carcinoma in situ， intraductal carcinoma in situ， infiltrating ductal carcinoma was gradually increased， which was respectively 8.3%（3/36）， 25.0%（1/4）， 10.0%（5/50） and 72.0%（108/150）， and there was a significant difference between these 4 groups（P<0.001）. The positive expression rate of CXCR4 protein in the breast cancer tissues of stage I， II， III and over III was 18.2%（2/11）， 80.4%（78/97） and 69.8%（30/43）， respectively， there was significant difference between the 3 groups（P<0.001）. The positive rate of CXCR4 protein in metastatic tumor tissues and non-metastatic breast cancer tissues was 88.4%（61/69） and 11.1%（15/135）， respectively. Conclusion CXCR4 is highly expressed in some breast cancer tissues， and is closely related to the type of breast cancer and the invasion and metastasis of breast cancer.

[Key words] CXCR4； Breast cancer； Tissue microarray； Immunohistochemistry

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率在我國呈上升趨勢。遠端器官轉移是乳腺癌失敗的主要原因之一，然而學界對于乳腺癌轉移的分子機制仍然不甚清楚。許多研究表明，腫瘤轉移與炎癥細胞趨化有著類似的過程。趨化因子可活化炎癥細胞并為之提供遷移信號、趨化其移動并使之準確定位于高濃度的炎癥因子區(qū)域。SDF-1（sclerotic stroma-derived factor 1）是骨髓基質細胞產生一種細胞因子，是趨化因子CXC家族的一員。研究顯示腫瘤組織間質中含較高濃度的SDF-1，并且在部分腫瘤細胞培養(yǎng)上清中也發(fā)現(xiàn)SDF-1的高表達[1]。

CXCR4是SDF-1已知的唯一受體。SDF-1/CXCR4軸的活化可介導多種惡性腫瘤細胞的運動能力。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中CXCR4的表達與腫瘤的轉移率呈正相關關系[2]；基因過表達技術發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞高表達CXCR4后其侵襲轉移能力明顯高于親本細胞。有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在不同類型和分期的乳腺癌組織中表達存在差異，但是由于樣本來源單一，統(tǒng)計結果難免偏頗[3-4]；其次，CXCR4在乳腺癌中的差異表達與是否轉移之間的關系不甚明晰。因此，2010年5月—2014年9月該研究擬以多中心來源的乳腺癌組織制作的組織芯片為檢測對象，運用免疫組織化學法檢測CXCR4在乳腺癌組織芯片中的表達，分析CXCR4表達量與乳腺癌組織分型分期以及淋巴結轉移的相關關系。

1 材料與方法

1.1 組織芯片

3套乳腺癌組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司，編號分別為BR10010c，BR8011和BC081120a。標本收集于2010年5月—2014年9月，共有正常乳腺組織36例和腫瘤組織204例，其中浸潤性導管癌組織150例、導管內原位癌組織50例、小葉原位癌組織4例；其中淋巴結轉移的病例69例；年齡27～81歲，平均年齡（47.9±10.5）歲。

1.2 方法

濃縮型羊抗人CXCR4抗體購自Santa Cruz公司。超敏SP（抗羊）試劑盒和DAB顯色試劑購自福州邁新公司。組織切片經二甲苯脫蠟、水化后，PBS洗3次各5 min；每張切片加100 μL 3%過氧化氫，孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次，除去PBS液；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；每張切片加100 μL的CXCR4抗體（1：200稀釋），在4℃下孵育過夜。37℃復溫45 min，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加羊抗鼠Ⅱ抗100 μl，孵育1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色1～5 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、照相。結果判定：綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比進行半定量處理：無染色（-）為0分，染色弱（+）為1分，染色強呈棕黃色（++）為2分，染色很強深棕色（+++）為3分；陽性細胞數(shù)10%～50%者為2分，51%～80%者為3分，﹥80%者為4分。上述兩項評分相乘：不管其染色強度，陽性細胞數(shù)﹤10%為（-），3分為（+），4～5分為（++），6～9分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計方法

用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用百分比（%）表6示，采用χ2檢驗，以P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

CXCR4在正常乳腺組織、導管內原位癌組織、小葉原位癌組織、浸潤性導管癌組織（圖1）中的陽性表達率分別為8.3%（3/36）、25.0%（1/4）、10.0%（5/50）、72.0%（108/150），4組間陽性表達率的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。CXCR4蛋白在不同級別的乳腺癌組織中的陽性率分別為I級18.2%（2/11）、II級80.4%（78/97）、III級以上69.8%（30/43），3組間陽性表達率的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；CXCR4蛋白在有轉移的腫瘤組織和未發(fā)現(xiàn)臨床轉移證據(jù)的乳腺癌組織中的陽性率分別為88.4%（61/69）和11.1%（15/135），兩組間陽性表達率的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）；但CXCR4蛋白的表達在不同年齡（<60歲或≥60）的乳腺癌患者中的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

SDF-1的趨化作用由CXCR4來介導。CXCR4在正常乳腺組織、乳腺、卵巢、前列腺表達很弱，但在乳腺癌和結腸癌中高表達[5]，同時在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)CXCR4表達，并且在轉移性乳腺癌細胞株和轉移性乳腺癌細胞株中具有高表達[6]。對前列腺癌組織研究發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白表達升高與腫瘤的轉移正相關[7]。表達CXCR4的腫瘤細胞在SDF-1的作用下從原發(fā)部位游走出來后通過血道和淋巴道向遠端組織轉移并形成轉移灶。在前列腺癌、乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4陽性的腫瘤細胞沿著SDF-1濃度梯度向高濃度遷徙，形成轉移灶。因此普遍認為，CXCR4的表達不僅是上皮細胞惡性程度的主要特征之一，也可作為腫瘤轉移能力的判斷指標[8]。CXCR4與SDF-1結合，可以增加腫瘤細胞黏附能力和侵襲性，并分泌多種血管生成因子[9]。Tamamura等[10]發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸在乳腺癌轉移發(fā)生中具有明顯作用。在體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞中加入SDF-1，癌細胞的增殖和侵襲力明顯加強，并且轉移能力也明顯上升；用CXCR4單抗處理后，癌細胞增殖、侵襲、轉移能力都受到抑制。

既往曾有幾項研究關注CXCR4的表達與乳腺癌轉移以及患者預后生存的關系，并指出CXCR4的表達與乳腺癌淋巴結轉移密切相關，且SDF-1/CXCR4軸的激活與患者預后成負相關[11-12]。但是，我們注意到這些研究的標本來源比較單一，為一個市級地區(qū)患病人群；雖然樣本量有上百例，但仍然有數(shù)據(jù)偏畸可能。因此該研究一改既往從地區(qū)醫(yī)院取材的限制[13]，轉而采用西安艾莉娜公司的多張乳腺癌組織芯片進行研究，這些芯片來源于多個地區(qū)的多個醫(yī)療機構，總樣本量達到204例，符合多中心研究的基本要求。該研究發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白在不同年齡和性別的乳腺癌組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義。但是，CXCR4蛋白在不同病理類型的乳腺癌中存在表達差異：浸潤性導管癌組織>導管內原位癌組織>小葉原位癌組織；其中在浸潤性導管癌組織中的陽性表達率最高（72%）；在不同級別的乳腺癌組織中CXCR4蛋白的表達也存在差異，在分化程度較低的組織中表達較高，提示CXCR4蛋白的表達可能與乳腺癌組織學分級呈正相關關系。最后，該研究對CXCR4蛋白表達與乳腺癌侵襲轉移的關系進行了分析，結果提示在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中CXCR4的表達比率明顯高于無淋巴結轉移的乳腺癌組織，其差異有統(tǒng)計學意義。

該研究檢測了CXCR4在各類型乳腺癌組織表達差異并分析了CXCR4的表達與病理類型和腫瘤轉移之間的關系，為研究CXCR4在腫瘤侵襲與轉移中所起作用并為進一步探索乳腺癌侵襲轉移機制提供了新的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2015-08-27）