樹脂XAD-16對埃博霉素B的解吸附條件優(yōu)化

龔國利, 趙婷峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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樹脂XAD-16對埃博霉素B的解吸附條件優(yōu)化

龔國利, 趙婷峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：埃博霉素B是一種由粘細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的新型抗腫瘤藥物，目前埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)主要采用原位分離發(fā)酵工藝，即在發(fā)酵過程中將產(chǎn)生的埃博霉素B從發(fā)酵液中不斷地吸附到大孔樹脂上.本文以吸附有有效成分埃博霉素B的大孔樹脂XAD-16為研究對象，確定出其最適解吸附條件.通過實(shí)驗(yàn)得出：重復(fù)3次解吸已基本將埃博霉素B完全解吸到溶劑中，80%甲醇溶液的解吸附能力最適，解吸附時(shí)間為120 min，解吸附pH為6.0，最適解吸附的轉(zhuǎn)速為200 r/min.該條件的確定無論對實(shí)驗(yàn)室還是對于工業(yè)化條件下的埃博霉素的提取都具有一定的指導(dǎo)意義.

關(guān)鍵詞：埃博霉素B; 大孔樹脂; 解吸附; 高效液相色譜法

0引言

埃博霉素B(Epothiones B)是一類粘細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的天然大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)[1,2]，具有抗腫瘤作用[3]，對多藥耐藥性細(xì)胞(包括耐紫杉醇類的細(xì)胞)具有明顯的細(xì)胞毒活性[4].目前，埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)主要采用原位分離發(fā)酵工藝[5]，也就是在發(fā)酵過程中將產(chǎn)生的埃博霉素B連續(xù)不斷地吸附到大孔樹脂上，目的是解除其對菌體生長的抑制效應(yīng)[6,7].在發(fā)酵結(jié)束后，收集樹脂，并對吸附有埃博霉素的樹脂進(jìn)行解吸，再對解吸液進(jìn)一步分離純化而得到的.

大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑[8],普遍應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[9,10]，對埃博霉素的解吸附是分離純化埃博霉素的第一步，也是關(guān)鍵的一步，然而對大孔樹脂的解吸附研究報(bào)道極少.因此，合理優(yōu)化大孔吸附樹脂的解吸附條件，對從發(fā)酵液中分離純化埃博霉素具有重要意義.

本課題組為了提高埃博霉素B的提取率及純度，在前期研究工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對大孔吸附樹脂XAD-16的解吸附條件進(jìn)行優(yōu)化，從而不僅可以提高埃博霉素B的純度及生產(chǎn)效率，而且還大大地縮短了生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)省了成本，為今后工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)，具有較高的藥用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景.

1材料與方法

1.1材料

(1)大孔吸附樹脂XAD-16：為弱極性的樹脂，購自德國Sigma公司；

(2)纖維堆囊菌SoF5-76(Sorangium cellulosum SoF5-76)：本實(shí)驗(yàn)室篩選保存菌.

1.2主要試劑及儀器

(1)試劑：Epothilone B標(biāo)準(zhǔn)品購于Singma公司；甲醇，乙醇，HCl，NaOH等均為市售分析純.

(2)儀器：恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；FA2014電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXJ-2高速電動離心機(jī)：金壇市精達(dá)儀器制造廠；Waters-2487-2420-1525高效液相色譜儀：美國Waters公司.C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5.0 um).液相色譜操作條件：以65%甲醇水作流動相，流速為1.0 mL/min，時(shí)間為30 min，上樣量為20μL,檢測波長為249 nm.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樹脂的預(yù)處理

首先，將大孔樹脂XAD-16用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液浸泡，置于搖床中震蕩24 h，取出用蒸餾水反復(fù)洗滌3～4次，至無明顯的乙醇味；接著再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行二次溶脹24 h后，蒸餾水洗滌至無乙醇味；最后，加入3%～5%HCl溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，再用3%～5%的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，備用.

1.3.2樣品的制備

將保藏在固體斜面培養(yǎng)基中的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，培養(yǎng)5～7 d后，轉(zhuǎn)接至液體M26培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d制成種子培養(yǎng)液，再將種子培養(yǎng)液按照5%(V/V)接種量接種到含2% XAD-16樹脂的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5～7 d后過濾收集樹脂.

向上述吸附有有效成分埃博霉素B的樹脂中加入一定量的甲醇水溶液，置于搖床上于室溫下以200 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行解吸附，一段時(shí)間后，取出過濾得到解吸液，并將其置于真空干燥箱中烘干，再加入少量甲醇復(fù)溶后離心，經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定.

1.3.3埃博霉素B含量的測定

埃博霉素B檢測：采用HPLC定量分析，液相色譜條件為：色譜柱，YWG，C18，10μm，250×4.6 mm ；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測器；檢測波長，249 nm；流動相，甲醇∶水=65∶35(體積比)；上樣體積，20μL ；時(shí)間，30 min；流速，1 mL/min.

埃博霉素B的定量測定采用本課題組已得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中峰面積大小來換算得到埃博霉素B的量.方程如下：

Y=0.132X +0.003 5(R2=0.999 0)

式中：X—埃博霉素的量;Y—埃博霉素的峰面積.

1.3.4靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)[12，13]

(1)靜態(tài)吸附.稱取不同量的樹脂各3份，置于埃博霉素B樣品溶液中，于搖床上震蕩24 h后，經(jīng)0.45 um濾膜過濾后，通過液相色譜測定殘余液中埃博霉素B的量.

吸附量：Q1=(C1-C2)V/W1

吸附率：E=C1V -C2V/C1V×100%

式中：C1為吸附前樣品液的起始濃度(mg/mL)；C2為吸附后殘余液的濃度(mg/mL)；V為加入埃博霉素B溶液的體積(mL)；W1為樹脂的質(zhì)量(g).

(2)靜態(tài)解吸.取靜態(tài)吸附試驗(yàn)完畢后的樹脂，置于250 mL錐形瓶中，加入一定量的解吸液，置于搖床200 rpm震蕩2 h后，經(jīng)0.45 um濾膜過濾后，通過液相色譜測定解吸液中埃博霉素B的含量.

解吸量：Q2=CV/W2

解吸率：D=CV/W×100%

式中：C為解吸液濃度(mg/mL)；V為解吸液體積(mL)；W2為大孔樹脂的重量(g)；W為吸附在樹脂上的埃博霉素B的總量(mg).

2結(jié)果與討論

2.1XAD-16大孔吸附樹脂的吸附量及吸附率

分別稱取1 g、2 g、3 g、4 g、5 g XAD-16大孔吸附樹脂加入到埃博霉素B樣品溶液中，置于搖床上震蕩24 h后，經(jīng)0.45 um濾膜過濾后，通過液相色譜測定殘余液中埃博霉素B的量.如圖1所示，橫坐標(biāo)為樹脂的量，縱坐標(biāo)分別是吸附量Q1和吸附率E.

圖1　不同樹脂的量對吸附能力影響

由圖1可見，吸附量Q1和吸附率E隨著樹脂量W1的增加而呈現(xiàn)先增后緩的趨勢，在W1為3 g處達(dá)到最大值，即分別達(dá)到20.18 mg/g、73%.這是由于該溶液在3 g樹脂下其吸附量幾乎接近于飽和狀態(tài)，再增加樹脂的量對吸附量影響不太大，所以曲線呈現(xiàn)先增后緩的趨勢.因此樹脂的量選用3 g作為下一步解吸實(shí)驗(yàn)的基本條件.

2.2解吸次數(shù)對埃博霉素B的解吸附能力影響

分別稱取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附樹脂于250 mL玻璃三角瓶,向其中加入100 mL的解吸劑甲醇溶液，過濾后將每次的解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇復(fù)溶并經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定5種情況下解吸液中埃博霉素B的含量.平行實(shí)驗(yàn)3次.如圖2所示，橫坐標(biāo)為解吸次數(shù)，縱坐標(biāo)分別是解吸量Q2和解吸率D.

由圖2可見，解吸量Q2和解吸率D隨著解吸次數(shù)的增多皆逐漸增大.當(dāng)解吸3次之后解吸量Q2及解吸率D分別達(dá)到15.5 mg/g、72.5%，若繼續(xù)增加解吸次數(shù)，Q2和D也都基本保持不變.因此，為了節(jié)省時(shí)間和有機(jī)溶劑用量，選取3次作為最適解吸次數(shù).

圖2　解吸次數(shù)對解吸能力影響

2.3不同濃度甲醇溶液對埃博霉素B的解吸附能力影響

不同濃度的甲醇溶液對埃博霉素B的解吸附能力具有一定的影響[14].將50%、60%、70%、80%、90%、100%的不同濃度甲醇水溶液100 mL加入到 XAD-16大孔吸附樹脂，置于搖床上以200 r/min解吸附120 min，過濾后將解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇復(fù)溶并經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定.平行實(shí)驗(yàn)3次.如圖3所示，橫坐標(biāo)為甲醇濃度，縱坐標(biāo)分別是解吸量Q2和解吸率D.

圖3　不同甲醇濃度對解吸能力影響

由圖3可見，解吸量Q2和解吸率D隨著甲醇濃度的增大呈現(xiàn)先增后趨于平緩.當(dāng)甲醇濃度低于或等于50%時(shí)，不能將有效成分從大孔樹脂上解吸下來；當(dāng)甲醇濃度高于50%時(shí)有效成分開始被解吸下來；當(dāng)甲醇濃度達(dá)到80%時(shí)，Q2和D均達(dá)到最大值，但繼續(xù)增加甲醇濃度，Q2和D并未繼續(xù)增大.因此，從節(jié)省有機(jī)溶劑用量方面考慮最終選取80%甲醇溶液作為解吸附劑.

根據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道：濃度為80%甲醇溶液對大孔樹脂的解吸附能力較好，與本文得出的結(jié)論相一致.

2.4時(shí)間對解吸附能力的影響

分別稱取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附樹脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入80%的甲醇水溶液100 mL，封口后置于搖床上于室溫下以200 r/min進(jìn)行解吸附，分別于30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min后，過濾將解吸液于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇復(fù)溶并經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定.平行實(shí)驗(yàn)3次.如圖4所示，橫坐標(biāo)為解吸時(shí)間，縱坐標(biāo)分別是解吸量Q2和解吸率D.

圖4　時(shí)間對解吸附能力的影響

由圖4可見，隨著解吸時(shí)間的延長，解吸量Q2和解吸率D均逐漸增加，一開始解吸量Q2和解吸率D變化幅度較大，當(dāng)達(dá)到120 min時(shí),Q2和D均達(dá)到較大值分別為16.67 mg/g、83%；之后隨著時(shí)間的延長，Q2和D稍有增加但變化不明顯.比較解吸時(shí)間120 nm、150 nm和180 min解吸量比較高，三者之間無顯著差異，解吸率都在80%以上，從節(jié)省時(shí)間提高效率的角度考慮，選取120 min作為最適解吸附時(shí)間.

2.5pH對解吸附能力的影響

分別稱取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附樹脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入100 mL濃度為80%的甲醇解吸液，在pH計(jì)監(jiān)控下分別調(diào)節(jié)解吸液的pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在搖床上于室溫下振蕩解吸附120 min，過濾收集解吸液，于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇復(fù)溶并經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定.平行實(shí)驗(yàn)3次.結(jié)果如圖5所示，橫坐標(biāo)為解吸液的pH值，縱坐標(biāo)分別是解吸量Q2和解吸率D.

圖5　pH對解吸能力的影響

由圖5可見，解吸量Q2和解吸率D隨著pH的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢.Q2和D在pH小于或大于6時(shí)，均小于pH=6時(shí)的值；當(dāng)pH=6時(shí),Q2和D幾乎達(dá)到曲線的頂點(diǎn)，其值分別為16.33 mg/g、81.68%，此時(shí)的最大值比最小值分別高出68.87%、70.17%.因此，pH=6.0可作為最適解吸pH條件.

2.6轉(zhuǎn)速對解吸附能力的影響

分別稱取3.0 g吸附有有效成分的XAD-16大孔吸附樹脂于250 mL玻璃三角瓶中，向其中加入100 mL濃度為80%的甲醇水解吸液，分別置于轉(zhuǎn)速為100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min、350 r/min的搖床上于室溫下振蕩解吸附120 min，過濾收集解吸液，于真空干燥箱中烘干，再加入1.0 mL甲醇復(fù)溶并經(jīng)0.45 um濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜測定.平行實(shí)驗(yàn)3次.結(jié)果如圖6所示，橫坐標(biāo)為搖床的轉(zhuǎn)速，縱坐標(biāo)分別是解吸量Q2和解吸率D.

由圖6可知，隨著轉(zhuǎn)速的增大，解吸量Q2和解吸率D呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但減小的趨勢不太明顯.一開始可能是轉(zhuǎn)速太小，埃博霉素B不能有效地被解吸，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)解吸量Q2和解吸率D分別達(dá)到最大值，再隨著轉(zhuǎn)速的增大，Q2和D變化的幅度較小.因此，可以確定出解吸附的最適轉(zhuǎn)速為200 r/min.

圖6　轉(zhuǎn)速對解吸能力的影響

3結(jié)論

本研究是采用原位吸附分離技術(shù)工藝，將有效成分吸附在大孔樹脂上，主要討論了大孔樹脂的最適解吸附條件，并且采用了直接進(jìn)行液相色譜檢測的手段，不僅提高了分析速度，而且提高了檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，為試驗(yàn)結(jié)果提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐.最終確定出最適的解吸附條件為：最適解吸次數(shù)為3次，解吸劑甲醇溶液的濃度為80%，解吸時(shí)間為120 min,解吸pH為6.0，解吸轉(zhuǎn)速為200 r/min.該結(jié)論對本有效成分的分離純化，以及后期想要獲得更高純度的物質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義.

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Optimization of desorption conditions for epothilone

B desorbed from macroporous resin XAD-16

GONG Guo-li， ZHAO Ting-feng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Epothilone B is a novel anti-tumor drugs produced by myxobacteria sorangium cellulosum.Now,epothilone B is produced through in situ separation of fermentation that epothilone B is adsorbed on macroporous resin continuously from fermentation liquor in the fermentation process.In this paper,macroporous resin XAD-16 with effective components of epothilone B were the main study object, and the best desorption conditions were determined.The results were as follows:the epothilone B had been basically complete desorbed to the solvent when desorption times was 3,80% aqueous methanol solution had the best adsorption ability,the best adsorption time was 120 min,the best adsorption pH was 6.0,the adsorption speed was 200 r/min.The conclusion had certain guiding significance both for laboratory and for industrialized extraction of epothilone.

Key words:epothilone B; macroporous resin; desorption; high performance liquid chromatography

中圖分類號：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)02-0121-05

作者簡介:龔國利(1976-)，男，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人，教授，博士，研究方向：應(yīng)用微生物技術(shù)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20906058)； 陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目(XSG2010009)

收稿日期:*2015-01-12