靶向大鼠PALM3基因的RNA重組腺病毒載體構(gòu)建及鑒定

靶向大鼠PALM3基因的RNA重組腺病毒載體構(gòu)建及鑒定*

付玉梅1陳旭昕2韓志海1,2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院， 北京 100037; 2.海軍總醫(yī)院呼吸科， 北京 100037)

【摘要】目的構(gòu)建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短發(fā)夾shRNA(RNA)重組腺病毒載體，干擾大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AE2 cells)中PALM3的表達(dá)。方法設(shè)計(jì)大鼠靶向PALM3基因的shRNA，插入穿梭質(zhì)粒pGV120-EGFP，行PCR、測(cè)序鑒定；將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293細(xì)胞，進(jìn)行重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包裝，并采用TCID50法測(cè)定病毒感染滴度；用此病毒感染大鼠AE2細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PALM3蛋白表達(dá)。結(jié)果穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功，進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)大鼠PALM3基因shRNA的重組腺病毒載體Ad-palm3-shRNA-EGFP，重組腺病毒感染滴度為3× 1010 pfu/mL，感染大鼠AE2細(xì)胞后顯著抑制目的蛋白表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了針對(duì)大鼠PALM3基因的shRNA重組腺病毒，顯著下調(diào)了大鼠AE2細(xì)胞中PALM3的表達(dá)，為進(jìn)一步探索PALM3在炎性失控性疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】短發(fā)夾RNA； paralemmin-3； 重組腺病毒載體； RNA干擾； 急性肺損傷

【中圖分類號(hào)】R 383.1+6【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81300050)，海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培養(yǎng)基金(CXPY201417)。

通訊作者：韓志海，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，Tel：18600310135， E-mail：zhihaihandoctor@163.com。

收稿日期：( 2015-05-14； 編輯： 張文秀)

Construction and identification of recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA of rat paralemmin-3FU Yumei1, CHEN Xuxin2, HAN Zhihai1,2

(1.NavyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100037,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China)

Abstract【】ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus vector (Ad.V) of short hairpin RNA (shRNA) against rat paralemmin-3 (PALM3) gene and identify the effects of down-regulation of recombinant Ad.V in rat alveolar epithelial 2 cells (AE2 cells). MethodsThe short hairpin oligonucleotide and complementary strand targeting the consensus sequences of PALM3 were designed and inserted into the shuttle plasmid pGV120-EGFP. The pGV120-palm3-shRNA-EGFP was identified by PCR and DNA sequencing. Recombinant viruses were generated by using 293 packaging cells co-transfected with the shuttle plasmid and the framing plasmid. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was determined by means of 50% tissue culture infectious dose. And then the recombinant adenovirus Ad-palm3-shRNA-EGFP was used to infect the rat AE2 cells and the protein expression of PALM3 was detected by Western blot. ResultsThe PCR and DNA sequencing results demonstrated that the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP was successfully constructed. Cytopathic effect and fluorescence detection indicated that the adenovirus was successfully packaged after co-transfection. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was 3×1010 pfu/mL. The PALM3 protein expression in the rat AE2 cells was significantly decreased. ConclusionThe recombinant adenovirus vectors target to rat PALM3 are successfully constructed and packaged and it could obviously knockdown the expression of PALM3 in the rat AE2 cells, which offers a basis for further research on the role of PALM3 in inflammatory diseases.

【Key words】Short hairpin RNA; Paralemmin-3; Recombinant adenovirus; RNA interfering; Acute lung injury

共同第一作者：陳旭昕

Paralemmin-3 (PALM3)屬于Paralemmin蛋白家族，可能作為“接頭”分子參與Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，且與TIR信號(hào)通路中的負(fù)性調(diào)控分子單免疫球蛋白白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)蛋白存在相互作用[1,2]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PALM3的表達(dá)可減輕人肺泡上皮細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與阻斷TIR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性有關(guān)[3]。深入研究PALM3在TIR信號(hào)通路中的作用及機(jī)制，有望為急性肺損傷等炎癥失控性疾病尋找到新的治療靶點(diǎn)。RNA干擾(RNA interfering, RNAi)是近年發(fā)展迅速的一項(xiàng)生物技術(shù)，已成為基因功能研究和基因治療的強(qiáng)有力工具[4]。本研究旨在以短發(fā)夾RNA(short hair RNA, shRNA)腺病毒為介導(dǎo)，構(gòu)建靶向大鼠PALM3基因的表達(dá)載體，為后繼研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料 DH5α感受態(tài)菌株及293細(xì)胞株由本室保存，大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell，AEC) Ⅱ型AEC購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；pGV120載體及空腺病毒載體Ad-EGFP均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DMEM、Ham’F12 細(xì)胞培養(yǎng)基及新生胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，Opti-MEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒及Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；PCR試劑、DNA連接試劑盒、內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ購(gòu)自Takara公司，膠回收及DNA純化試劑盒購(gòu)自上海生工有限公司，引物合成及AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自加拿大Microbix公司；抗PALM3多克隆抗體均購(gòu)自Santa cruz公司；GAPDH抗體、ECL-PLUS發(fā)光試劑盒、蛋白定量和細(xì)胞總蛋白提取試劑盒均為江蘇碧云天公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)293細(xì)胞用于包裝和擴(kuò)增腺病毒，用含有10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，大鼠Ⅱ型AEC 細(xì)胞用含10%胎牛血清的Ham's F12 培養(yǎng)基在37.0℃、5% CO2及95%濕度條件下培養(yǎng)，隔天換液，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2大鼠PALM-3基因特異性shRNA靶序列的選擇及合成針對(duì)Genebank中大鼠PALM3基因的序列(Gene ID: 100359592)，按照RNAi序列設(shè)計(jì)原則，選擇AGATCTTGATGGAGGGTTT為干擾靶序列，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成含干擾序列的引物。退火形成雙鏈DNA oligo，在其兩端連接上EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點(diǎn)粘端，并BLAST同源性分析。由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成寡核苷酸序列，正義鏈為5′CCGGGGAGATCTTG ATGGAGGGTTTCTCGAGAAACCCTCCATCAAG ATCTCCTTTTTG3′，反義鏈為5′AATTCAAAAA GGAGATCTTGATGGAGGGTTTCTCGAGAAAC CCTCCATCAAGATCTCC3′。

1.2.3穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP構(gòu)建用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切穿梭質(zhì)粒pGV120，酶切產(chǎn)物純化后，用DNA連接酶連接線性化的pGV120及退火后的雙鏈DNA，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上過夜，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)的上游引物：5′CCATGATTCCTTCATATTTGC3′，下游引物：5′GAGGCCAGATCTTGGGTG3′；對(duì)PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆小提質(zhì)粒并送檢測(cè)序。

1.2.4重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP制備及滴定測(cè)定按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體說明書將骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1, 3Cre和上述穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，24 h后觀察EGFP表達(dá)，培養(yǎng)10 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)CPE且視野中局部或全部為綠色熒光時(shí)，表明重組腺病毒包裝成功。當(dāng)90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，裂解細(xì)胞并收集病毒上清，用所收集的上清再感染293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)大生產(chǎn)與純化。經(jīng)離子交換及過篩純化后，病毒液保存于-70℃冰箱中備用；制備1×105/mL的293細(xì)胞懸液，100μl/孔接種至96孔板，將病毒液從1×1011稀釋度開始進(jìn)行8個(gè)稀釋梯度的稀釋并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)9個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立陰性對(duì)照，常規(guī)孵育10天，記錄細(xì)胞CPE情況。

1.2.5Western blot檢測(cè)Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)PALM3蛋白表達(dá)制備大鼠Ⅱ型AEC懸液，以3×105/孔接種到6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)60~70%時(shí)，棄培養(yǎng)液加入病毒液Ad-palm3-shRNA-EGFP或Ad-EGFP(對(duì)照)1 mL/well到6孔板(MOI = 50)。90 min后加入20%FBS完全培養(yǎng)基至終體積2 mL，孵育48h。按碧云天公司細(xì)胞總蛋白提前試劑盒操作說明書，提前細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度后，取25 μl樣品行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)至PVDF膜, 脫脂牛奶封閉后，依次第一抗體、第二抗體結(jié)合后，ECL發(fā)光液中顯色。放入GBox-HR凝膠成像分析系統(tǒng)中攝像分析，用Photoshop 7.0軟件分析圖像，測(cè)定各條帶積分光密度值。以GAPDH為內(nèi)參照。

2結(jié)果

2.1穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的鑒定以含重組質(zhì)粒的菌液為模板行PCR鑒定。連接入shRNA片段的陽(yáng)性克隆PCR片段大小為338bp，沒有連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為304bp，見圖1；挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)shRNA基因序列完全正確已成功插入質(zhì)粒載體中，見圖2。

圖1重組質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的PCR鑒定

Figure 1The identification of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP by PCR

注：1：陰性對(duì)照(ddH2O)；2：自連對(duì)照(空載體自連對(duì)照組)；3：Marker；4：以含pGV120-palm3-shRNA-EGFP質(zhì)粒菌液為模板

2.2重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包裝及滴定測(cè)定骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1, 3Cre和穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞10 d后，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞病變(典型CPE現(xiàn)象是：細(xì)胞排列松散，多數(shù)細(xì)胞脫落，游離并呈現(xiàn)集攏現(xiàn)象，出現(xiàn)葡萄樣病變)，且EGFP充滿視野中的絕大多數(shù)細(xì)胞，表明腺病毒包裝成功，見圖3；梯度稀釋病毒原液，感染接種于96孔板中的293細(xì)胞，分析并記錄CPE結(jié)果，按TCID50法求得重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP感染滴度為3×1010pfu/mL。

2.3Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞后PALM3蛋白表達(dá)重組腺病毒感染大鼠Ⅱ型AEC 48小時(shí)后用Western blot檢測(cè)PALM3蛋白表達(dá)，結(jié)果表明Ad-palm3-shRNA-EGFP感染后可顯著抑制PALM3蛋白表達(dá)(P<0.05)；而與正常大鼠Ⅱ型AEC相比，空腺病毒載體Ad-EGFP感染Ⅱ型AEC后PALM3蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

圖2穿梭質(zhì)粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的測(cè)序結(jié)果

Figure 2Sequencing results of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP

圖3重組腺病毒包裝過程中的細(xì)胞病變效應(yīng)及EGFP表達(dá)(×100)

Figure 3The cytopathic effect of 293 cells and the expression of EGFP in the process of packaging of recombinant adenovirus

注:A: 正常生長(zhǎng)的293細(xì)胞；B: 轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒及骨架質(zhì)粒10天后出現(xiàn)CPE的293細(xì)胞；C: 轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒及骨架質(zhì)粒后10天后熒光顯微鏡下觀察293細(xì)胞形態(tài)

3討論

Paralemmin蛋白家族包括四個(gè)成員：paralemmin-1，paralemmin-2，paralemmin-3及palmdephin[5]。PALM3于1992年由Cornish等首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道[1]，相繼文獻(xiàn)報(bào)道，PALM3可能與膜蛋白的運(yùn)輸或靶向有關(guān)，可能作為“接頭”分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。在前期研究中，我們通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與TIR信號(hào)通路負(fù)調(diào)控分子單免疫球蛋白白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)蛋白的相互作用蛋白[2, 7]，PALM3為被篩選出來蛋白分子之一，后經(jīng)進(jìn)一步免疫共沉淀驗(yàn)證后，確認(rèn)PALM3為單免疫球蛋白白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)蛋白的相互作用蛋白。后繼研究中，我們以小分子干擾RNA(siRNA)為介導(dǎo)直接轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示下調(diào)PALM3的表達(dá)可減輕人肺泡上皮細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]。

圖4大鼠Ⅱ型AEC細(xì)胞中PALM3蛋白表達(dá)的Western blot分析

Figure 4The protein expression of PALM3 in the rat AE2 cells after infection

注：1.正常大鼠Ⅱ型AEC；2.感染Ad-palm3-shRNA-EGFP大鼠Ⅱ型AEC；3.感染Ad-EGFP大鼠Ⅱ型AEC

RNA沉默技術(shù)是通過導(dǎo)入細(xì)胞19~23 nt的小分子干擾RNA(siRNA)，降解同源mRNA，從而高效、特異性阻斷目的基因表達(dá)[8]。研究表明，短發(fā)夾RNA(shRNA)對(duì)于靶基因的干擾作用明顯優(yōu)于siRNA[9]。shRNA的導(dǎo)入需要基因轉(zhuǎn)移載體，目前基因轉(zhuǎn)移載體主要分為病毒載體與非病毒載體，非病毒載體的安全性高，但轉(zhuǎn)染效率低，在活體組織中表達(dá)不穩(wěn)定，限制了非病毒載體在在體基因功能研究中的應(yīng)用。為進(jìn)一步在急性肺損傷等炎性失控疾病的動(dòng)物模型中研究PALM3功能與作用機(jī)理，需依賴于構(gòu)建高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移載體。重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，分裂和非分裂細(xì)胞均可被轉(zhuǎn)染，病毒基因組不整合宿主染色體，滴定高與容載量大等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，本研究中選擇腺病毒作為載體構(gòu)建了針對(duì)大鼠paralemmin-3基因的shRNA重組腺病毒載體，經(jīng)過對(duì)穿梭質(zhì)粒的PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確后，在293細(xì)胞中利用AdMax系統(tǒng)進(jìn)行重組、包裝，并在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中驗(yàn)證了其干擾效率，經(jīng)Western blot檢測(cè)顯示研究所構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-palm3-shRNA-EGFP具有良好的干擾效果，顯著降低了大鼠Ⅱ型AEC中PALM3的表達(dá)水平，可以用于后繼實(shí)驗(yàn)。

4結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了靶向大鼠paralemmin-3基因的shRNA重組腺病毒載體，為進(jìn)一步在細(xì)胞水平及活體動(dòng)物水平研究paralemmin-3基因的功能提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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