桂皮醛對激素誘導(dǎo)的破骨細胞分化過程的保護作用及分子機制

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.020.html

桂皮醛對激素誘導(dǎo)的破骨細胞分化過程的保護作用及分子機制

張洪海1,2，郭鈺琪1，李霞1，王麗1，周憲賓1，鄭曉丹1,2，賴楠楠1,2，姚成芳1

(1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟南250062；2.濟南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟南250200)

中國圖書分類號：R284.1；R285.5；R329.24；R336；R681；R977.1

摘要：目的研究桂皮醛對激素誘導(dǎo)的體外破骨細胞增殖分化及骨吸收功能增強的保護作用及分子機制。方法RANKL聯(lián)合M-CSF體外誘導(dǎo)RAW264.7細胞分化為破骨細胞，分為對照組、地塞米松處理組和不同濃度(11.6、23.2、46.4 μg·L`(-1))桂皮醛(cinnamic alde byde,CA)干預(yù)組；TRAP染色試劑盒鑒定成熟破骨細胞；MTT法觀察地塞米松和桂皮醛在不同時間點對破骨細胞增殖的抑制作用；ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)液上清中TRACP5b 的表達水平；RT-PCR分析破骨細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RANK、NFATc1)mRNA的表達狀態(tài)。結(jié)果地塞米松處理后，破骨細胞的增殖分化及骨吸收功能明顯增強(P<0.05)；而經(jīng)不同濃度桂皮醛干預(yù)后，與地塞米松組相比，細胞增殖活性、上清液中TRACP-5b的含量以及RANK、NFATc1mRNA的表達水平隨藥物濃度的增加呈劑量依賴性降低(P<0.05)。結(jié)論桂皮醛可有效抑制激素誘導(dǎo)的破骨細胞的增殖及骨吸收功能，其作用機制可能是通過下調(diào)RANK以及下游 NFATc1基因的表達。

關(guān)鍵詞：桂皮醛；破骨細胞；細胞增殖；TRAP5b；RANK； NFATc1

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.020

文章編號：

文獻標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0092-05

收稿日期：2014-09-20,修回日期：2014-11-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81202778，81373670)；山東省自然科學(xué)基金資助項目(No ZR2010HQ043，ZR2013 HQ038)；山東省科技攻關(guān)計劃(No 2012GSF11908，2012GSF11840)；山東省中管局項目(No 2013-216，2013-218)；濟南市科技明星計劃項目(濟科合字2012)

作者簡介：張洪海(1989-)，男，碩士生，研究方向：基礎(chǔ)免疫學(xué)，E-mail:zhang3hh1989@163.com;

通訊作者姚成芳(1966-)，女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：基礎(chǔ)免疫學(xué)，，Tel: 0531-82919929,E-mail: yaocf9941@163.com

Abstract:AimTo investigate the protective effect of cinnamic aldehyde (CA) on hormone-induced osteoclasts proliferation and bone resorption in vitro and its molecular mechanisms. MethodsRAW264.7 cells induced into osteoclast were treated with RANKL and M-CSF and then were divided into control group, dexamethasone (DEX) group and different doses of CA (11.6, 23.2, 46.4 μg·L`(-1)) groups. OCs were observed after tartrate resistant acid phosphatase(TRAP) staining. The cell proliferation was determined by MTT assay at different time points. The expression levels of TRACP5b in cell cultured supernatants were measured by ELISA. RT-PCR technique was applied to examine the transcriptional levels of RANK and NFATc1. ResultsIn MTT assay, the proliferation of osteoclasts stimulated by dexamethasone was promoted seriously compared with negative control group (P<0.05). Meanwhile, DEX could strengthen the content of TRACP5b and up-regulate the expressions of RANK and NFATc1 mRNA. After administration of CA, the proliferation was inhibited, while the enhanced expression of TRAP5b was reversed，and the over-expressions of RANK and NFATc1 mRNA were obviously down-regulated in a time-and-dose-dependent manner (P<0.05). ConclusionThe results suggest that CA inhibits proliferation and bone resorption of osteoclast induced by DEX, which may be mediated by down-regulation of RANK and NFATc1 mRNA.

骨重建依賴于成骨細胞(osteoblast,OB)骨形成和破骨細胞(osteoclast,OC)骨吸收之間的動態(tài)平衡。糖皮質(zhì)激素通過促進破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收增強，可導(dǎo)致骨代謝性疾病，如骨質(zhì)疏松癥及炎癥性骨丟失等[1]，目前國內(nèi)外關(guān)于骨代謝疾病的治療也多靶向OC。桂皮醛(cinnamic aldehyde,CA)是中藥肉桂揮發(fā)油的主要成分，已有研究證實[2],低濃度的CA能促進成骨細胞的成骨功能，但關(guān)于CA對激素誘導(dǎo)的OC骨吸收功能增強的抑制作用及其分子機制研究較少。本實驗以目前公認的唯一成系的破骨細胞前體細胞——RAW264.7細胞為研究對象[3]，體外觀察了CA對激素誘導(dǎo)的OC細胞增殖分化及骨吸收功能增強的抑制作用，并探討其分子機制，為CA有效防治骨代謝疾病提供的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要材料、儀器小鼠破骨細胞前體細胞-RAW264.7(中科院上海細胞庫)，桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)品(CA，國家食品藥品檢驗所)，新生胎牛血清(比利時BI公司)，改良型α-MEM、RPMI 1640培養(yǎng)基 (美國Gibco公司)，sRANKL、M-CSF(美國Peprotech)，TRAP試劑盒(美國Sigma公司)，MTT檢測試劑盒(碧云天公司)，TRACP5b ELISA Kit(武漢華美，CSB-E08492m)，TRIzol (美國Invitrogen公司) ，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(北京Promega公司)、2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司) ，ND-1000分光光度計(Gene Company，美國)。

1.2方法

1.2.1破骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7細胞以5×104個/孔的密度接種于放有玻璃片的6孔板中，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下，用含有10% FBS、100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素的改良型α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔加入RANKL (50 μg·L-1)和M-CSF(10 μg·L-1)，隔2 d換液1次，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d。

1.2.2TRAP染色法鑒定成熟破骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后取出玻璃片，按照TRAP染色試劑盒說明，用PBS緩沖液洗1次，浸入固定液(25 mL檸檬酸鹽溶液，65 mL丙酮，8 mL 體積分數(shù)0.37甲醛)固定30 s，用雙蒸水輕輕的沖洗后，放入預(yù)熱的TRAP染液中，37 ℃避光孵育1 h，雙蒸水洗1 min，然后用蘇木精復(fù)染2 min，堿性自來水沖洗，直至能看到部分顯藍色為止。倒置顯微鏡下觀察，以TRAP染色陽性,細胞核≥3個為破骨細胞。

1.2.3MTT法檢測藥物對破骨細胞增殖分化的影響RAW264.7細胞以1×108個·L-1的密度接種于96孔板上，每孔100 μL細胞懸液，分為對照組、地塞米松組和地塞米松+不同濃度的桂皮醛干預(yù)組。各處理組(對照組除外)在細胞培養(yǎng)過程中分別加入100 μL含地塞米松(1×10-6mol·L-1)和不同濃度桂皮醛(11.6、23.2、46.4 μg·L-1)的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)96 h，每組設(shè)5個平行孔，于終止前4 h每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，加入150 μl/孔DMSO，在振蕩器上振蕩10 min，待結(jié)晶溶解后在波長為490 nm的酶標(biāo)儀上測其光密度值。計算細胞生長抑制率，同時進行臺盼藍染色觀察細胞活力并計數(shù)。生長抑制率計算公式：生長抑制率/%=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。(對照組：不加藥組；實驗組：加藥組)

1.2.4ELISA法檢測藥物對破骨細胞骨吸收功能的影響RAW264.7細胞以5×104個cell/孔接種于24孔板上，分為對照組、地塞米松組和地塞米松+不同濃度的CA干預(yù)組。分別加入地塞米松(1×10-6mol·L-1)和不同濃度的CA(對照組除外)，細胞每3天換液1次，共培養(yǎng)7 d。

收集細胞培養(yǎng)液，ELISA法檢測培養(yǎng)液中骨吸收功能標(biāo)志物——抗酒石酸酸性磷酸酶TRACP5b的含量。按說明書要求，終止反應(yīng)后立即采用酶標(biāo)儀450 nm讀取數(shù)據(jù)，記錄分析檢測結(jié)果。

1.2.5引物的設(shè)計與合成GAPDH、RANK、NFATc1引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見Tab 1。

Tab 1　Sequences of PCR primer and the products’s length

1.2.6RT-PCR測定轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達水平RNA提取與分析：破骨細胞藥物作用7 d后，采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度儀檢測A260 /A280比值，驗證RNA純度和濃度。

RT反應(yīng)體系為：采用oligo dT為RT反應(yīng)引物，總反應(yīng)體系為60 μL，包括4 μg 的總RNA，5×RT buffer 12 μL、RNA酶抑制劑120 U，10 mmol·L-1dNTP 6 μL，M-MLV 600 U，DEPC水調(diào)總體積至60 μL，70℃ 5 min，37℃ 5 min ，42℃，1 h，70℃，10 min。

PCR擴增：PCR總反應(yīng)體積25 μL，包括2× Taq MasterMix 12.5 μL，cDNA 4 μL，目的基因引物(Sense+Antisense)(10 μmol·L-1)2 μL，補DEPC水至25 μL，進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，58℃～60℃ 1 min，72℃ 1 min，26個循環(huán)后，70℃延長10 min。

2結(jié)果

2.1成熟破骨細胞的鑒定剛接種的RAW264.7細胞懸液中,細胞呈圓形，貼壁后細胞呈類圓形、橢圓形，少許為梭形，多為單核。RANKL和M-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)5 d后，培養(yǎng)瓶中細胞多為融合的多核細胞，體積較大，有皺褶(Fig 1A、B)。TRAP染色后，倒置顯微鏡下觀察，出現(xiàn)大量多核細胞(核≥3個)，胞核藍染，細胞大，染成淡紅，胞膜邊界不整，周邊可見偽足伸展(Fig1C、D)。

Fig 1　Morphological identification of mature osteoclasts

A: Raw 264.7 cells；B: Raw 264.7 cells were treated for 5 days；C:TRAP staining(×200);D: TRAP staining(×400)

2.2桂皮醛對地塞米松誘導(dǎo)的破骨細胞增殖的抑制作用經(jīng)臺盼藍染色，藥物處理組及對照組細胞活力均在0.90以上，不伴有死細胞比例增高。MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，地塞米松能夠明顯促進細胞的增殖(結(jié)果未顯示)，這一結(jié)果與文獻報道一致[4]；而經(jīng)不同濃度的桂皮醛(11.6、23.2、46.4 μg·L-1)干預(yù)24 h后，與地塞米松組相比，破骨細胞的增殖抑制無明顯變化；48 h后，抑制率明顯增強，分別為: 0.039±0.028、0.228±0.023、0.295±0.025；72 h后，抑制率分別為0.175±0.021、0.296±0.014、0.332±0.013；96 h后，抑制率達到0.182±0.033、0.331±0.021、0.381±0.017，差異有顯著性(P<0.05)?？梢?1.6~46.4 μg·L-1的CA能夠不同程度的抑制破骨細胞的增殖活性，其效應(yīng)呈明顯的時間、劑量依賴性 (Fig 2)。

Fig 2　Inhibitory effect of CA on osteoclasts

CA1: 11.6 μg·L-1；CA2:23.2 μg·L-1；CA3:46.4 μg·L-1

2.3桂皮醛對地塞米松誘導(dǎo)的骨吸收功能增強的抑制作用ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，地塞米松能夠明顯增加上清中TRACP5b的活性表達(P<0.05)；而不同濃度CA干預(yù)后，與地塞米松組相比，TRACP5b的表達受到明顯的抑制(P<0.05)，其抑制效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性(Fig 3)。

Fig 3　Reverse effects of CA on DEX-induced

CA1: 11.6 μg·L-1；CA2:23.2 μg·L-1；CA3:46.4 μg·L-1.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsDEX group

2.4桂皮醛對破骨細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響RT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后，RANK、NFATc1 mRNA的表達均明顯升高(P<0.05)，而CA干預(yù)后，與地塞米松組相比，RANK、NFATc1 mRNA的表達均出現(xiàn)不同程度降低，且隨藥物濃度的升高抑制作用越明顯 (Fig 4)。

Fig 4Down-regulatory effect of CA on DEX-induced

overexpressions of RANK, NFATc1 mRNA

A: The expression of RANK mRNA;B: The expression of NFATc1mRNA,CA1: 11.6 μg·L-1；CA2:23.2 μg·L-1；CA3:46.4 μg·L-1，*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsDEX group

3討論

近年來，激素類藥物在重大感染性疾病和器官移植中的應(yīng)用所引發(fā)的醫(yī)源性骨代謝病呈整體上升之勢，而目前國內(nèi)外關(guān)于骨代謝疾病的治療多靶向OC，本研究中用RANKL和M-CSF來誘導(dǎo)小鼠破骨樣前體細胞——RAW264.7細胞[4]，使其分化成為成熟的破骨細胞作為研究對象。MTT結(jié)果證實，地塞米松能夠促進OC細胞增殖分化，并具有明顯的時間依賴性，這一結(jié)果亦與文獻報道一致[5]；TRAP5b是破骨細胞特異性來源的骨吸收標(biāo)志物，本研究用ELISA方法檢測其活性，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，地塞米松誘導(dǎo)后TRAP5b的活性明顯增強。而隨著CA濃度的增加，OC的增殖和TRAP5b的活性受到抑制，并具有明顯的劑量依賴性。

OC分化因子RANKL與其配體 (RANK)及誘騙配體—骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是近年來骨代謝研究領(lǐng)域中影響OC分化和功能、調(diào)節(jié)骨重建的核心調(diào)節(jié)因素，RANKL/RANK/OPG信號通路在生理和病理性骨重建中起決定性作用[6]。RANKL 可與OC前體細胞和OC膜上的 RANK結(jié)合,引起級聯(lián)反應(yīng)，從而促進OC分化、成熟，增強骨吸收功能，而RANK減少可以使RANKL結(jié)合不足，細胞信息通路不能順利傳導(dǎo)給細胞內(nèi)，從而使OC分化、成熟受限，骨吸收功能下降[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松誘導(dǎo)后，RANK mRNA表達明顯增強，而11.6~46.4 μg·L-1的桂皮醛能夠使RANK mRNA表達下降，故我們推測RANK mRNA的表達下降導(dǎo)致RANK蛋白翻譯的減少，封閉RANKL/RANK的信息傳遞，使OC前體細胞不能分化融合形成OC，抑制OC生成和骨吸收活性。同時，本研究還觀察了NFATc1 mRNA的表達變化。NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1)是破骨細胞成熟過程中最主要的調(diào)節(jié)子，體內(nèi)外研究已證實NFATc1基因在破骨細胞生成中的必要及充分的作用[8]。NFATc1在調(diào)節(jié)破骨細胞特異基因表達的方面具有重要作用[9]，并且是RANKL/RANK通路下游信號分子[10]。近年來，NFATc1已作為抗破骨細胞療法的一個首要靶向目標(biāo)[11-12]。RT-PCR結(jié)果表明，伴隨著CA濃度的升高，NFATc1的mRNA表達明顯降低，進一步證實了CA能夠抑制破骨細胞的分化成熟，其機制可能是通過降低RANKL/RANK信號通路中RANK、NFATc1 mRNA的表達。

本研究結(jié)果揭示：在體外培養(yǎng)的情況下，CA通過降低RANK、NFATc1mRNA的高表達，從而有效降低激素誘導(dǎo)的破骨細胞增殖分化以及骨吸收功能的增強。目前在防治骨相關(guān)疾病當(dāng)中，中藥所占份額極低，這主要是由于目前中藥對防治骨相關(guān)疾病的細胞選擇性、療效穩(wěn)定性和作用針對性的研究基礎(chǔ)較弱，科研依據(jù)不夠充分，我們的實驗結(jié)果可能是CA臨床有效防治醫(yī)源性骨代謝疾病的藥理機制和物質(zhì)基礎(chǔ)，為CA用于骨代謝病的早期防治提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。但畢竟骨組織是多種細胞生活在一起的整體，藥物對體內(nèi)骨環(huán)境的影響是不能僅僅通過體外培養(yǎng)的實驗結(jié)果來推斷的，所以建立成骨細胞和破骨細胞共存的細胞系以及小鼠體內(nèi)實驗是我們下一步的重點。

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Protective effect of cinnamic aldehyde on hormone-induced osteoclasts

differentiation and its molecular mechanisms

ZHANG Hong-hai1,2, GUO Yu-qi1, LI Xia1, WANG Li1, ZHOU Xian-bin1, ZHENG Xiao-dan1,2,

LAI Nan-nan1,2, YAO Cheng-fang1

(1.InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China;

2.AcademyofMedicalandLifeScience,JinanUniversity,Jinan250200,China)

Key words:cinnamic aldehyde; osteoclasts; proliferation; TRAP5b; RANK; NFATc1