沙棘多糖提取物對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝損傷的保護作用及其對TLR4,SOCS3表達的調控①

王　雪　張　威　劉　歡　謝基明　董仕超　陳俊娜　王　巖　劉　芳　王玉珍

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特010018)

[摘　要]　目的：研究沙棘多糖提取物對LPS聯(lián)合D-GalN誘導的肝損傷的保護作用以及對肝臟TLR4,SOCS3蛋白表達的調控。方法：將C57BL/6系雄性小鼠隨機分為6組，即空白對照組、模型組、地塞米松陽性對照組、沙棘多糖低、中、高劑量組；沙棘多糖低、中、高劑量組分別以50、100和200 mg/kg沙棘多糖溶液連續(xù)灌胃14 d。通過腹腔注射LPS(10 μg/kg)和D-GalN(700 mg/kg)建立急性肝損傷模型，陽性藥物組在建模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。建模4 h后采集血清和肝臟組織，檢測血清ALT和AST水平，HE染色觀察沙棘多糖提取物對肝損傷的影響。Western blot檢測TLR4，SOCS3的表達情況。結果：沙棘多糖提取物顯著降低了LPS/D-GalN誘導的小鼠血清中ALT和AST水平(P<0.01，P<0.05)；HE染色觀察顯示，沙棘多糖明顯減輕了肝細胞損傷和炎性細胞浸潤。Western blot檢測表明，沙棘多糖提取物抑制了LPS/D-GalN誘導的TLR4的表達,但是對SOCS3的表達影響不明顯。結論：沙棘多糖提取物有效抑制了LPS/D-GalN誘導的肝損傷，這種保護作用可能是通過抑制TLR4的表達來發(fā)揮作用的，而非通過調控SOCS3來實現(xiàn)的。

[關鍵詞]　沙棘多糖;LPS;D-GalN;肝損傷;TLR4；SOCS3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.004

沙棘多糖提取物對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝損傷的保護作用及其對TLR4,SOCS3表達的調控①

王雪張威劉歡謝基明②董仕超陳俊娜王巖劉芳王玉珍

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特010018)

[摘要]目的：研究沙棘多糖提取物對LPS聯(lián)合D-GalN誘導的肝損傷的保護作用以及對肝臟TLR4,SOCS3蛋白表達的調控。方法：將C57BL/6系雄性小鼠隨機分為6組，即空白對照組、模型組、地塞米松陽性對照組、沙棘多糖低、中、高劑量組；沙棘多糖低、中、高劑量組分別以50、100和200 mg/kg沙棘多糖溶液連續(xù)灌胃14 d。通過腹腔注射LPS(10 μg/kg)和D-GalN(700 mg/kg)建立急性肝損傷模型，陽性藥物組在建模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。建模4 h后采集血清和肝臟組織，檢測血清ALT和AST水平，HE染色觀察沙棘多糖提取物對肝損傷的影響。Western blot檢測TLR4，SOCS3的表達情況。結果：沙棘多糖提取物顯著降低了LPS/D-GalN誘導的小鼠血清中ALT和AST水平(P<0.01，P<0.05)；HE染色觀察顯示，沙棘多糖明顯減輕了肝細胞損傷和炎性細胞浸潤。Western blot檢測表明，沙棘多糖提取物抑制了LPS/D-GalN誘導的TLR4的表達,但是對SOCS3的表達影響不明顯。結論：沙棘多糖提取物有效抑制了LPS/D-GalN誘導的肝損傷，這種保護作用可能是通過抑制TLR4的表達來發(fā)揮作用的，而非通過調控SOCS3來實現(xiàn)的。

[關鍵詞]沙棘多糖;LPS;D-GalN;肝損傷;TLR4；SOCS3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.004

中圖分類號①本文為國家自然科學基金 (31270922，81260662，81560677)項目。;②內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，呼和浩特010020。

作者簡介：王雪(1991年-)，女，主要從事免疫藥理方面的研究，E-mail:920159706@qq.com。

通訊作者及指導教師：王玉珍(1976年-)，女，教授， 主要從事天然免疫應答的調控研究，E-mail:wangyuzhen817@126.com。

[Abstract]Objective:To study the protective effects of sea buckthorn polysaccharide extracts on lipopolysaccharide(LPS)/D-galactosa mine (D-GalN)-induced liver injury in mice and investigate the regulation on hepatic TLR4 and SOCS3 expression.Methods: C57BL/6 male mice were randomly divided into six groups:control group,model group,dexamethasone positive control group,low,medium and high dose group of sea buckthorn polysaccharide.Mice in the sea buckthorn polysaccharides low,medium and high dose group were gavaged with 50,100 and 200 mg/kg sea buckthorn polysaccharide extracts for 14 days respectively.Acute liver injury model were established by intraperitoneal injection of LPS(10 μg/kg) and D-GalN (700 mg/kg).The mice in the dexamethasone positive control group were intraperitoneally injected with dexamethasone (10 mg/kg) before model establishment.Serum and liver samples were collected after model establishment for 4 h .Serum levels of ALT and AST were detected.Histological changes of liver tissue were observed by HE staining.Hepatic expression of TLR4 and SOCS3 was detected by Western blot.Results: Sea buckthorn polysaccharide significantly inhibited LPS/D-GalN-induced elevation in serum levels of ALT and AST.It also alleviated liver cell injury and inflammatory infiltration.Western blot results showed that sea buckthorn polysaccharide inhibited LPS/D-GalN-induced TLR4 expression.SOCS3 expression was not dramatically influenced by sea buckthorn polysaccharide supplementation.Conclusion: Sea buckthorn polysaccharide protects against LPS/D-GalN-induced liver injury.This protective effects may be achieved by inhibiting the expression of TLR4 but not associated with modulation on SOCS3 expression.

Protective effects of sea buckthorn polysaccharide extracts on LPS/D-GalN-induced liver injury in mice and modulation on TLR4,SOCS3 expression

WANGXue，ZHANGWei,LIUHuan,XIEJi-Ming,DONGShi-Chao，CHENJun-Na，WANGYan，LIUFang，WANGYu-Zhen.CollegeofLifeScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China

[Key words]Sea buckthorn polysaccharide;LPS;D-GalN;Liver injury;TLR4；SOCS3

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)，屬于胡頹子科沙棘屬植物，主要產于我國西北、東北、華北及西南等十多個省區(qū)。沙棘具有活血散瘀、化痰寬胸、補脾健胃、生津止渴、清熱止瀉的功效。早在公元八世紀，沙棘在蒙醫(yī)和藏醫(yī)中就被廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)，沙棘的果實、莖皮、葉子等部分器官中含有豐富的營養(yǎng)及藥用成分，具有很高的食用和藥用價值[1]。

多糖具有重要的免疫調節(jié)作用，廣泛存在于植物、動物、微生物中。研究顯示，植物多糖對急慢性肝臟損傷疾病有療效[2-5]。我國是一個肝病大國，保肝和護肝也成為大眾關注的重點。沙棘多糖的保肝作用及其機制研究還很缺乏。

TLR4是天然免疫應答中的重要模式識別受體，通過結合脂多糖(LPS)后刺激促炎性因子的大量產生，參與多種肝病的病理過程[6]。 SOCS3是一種細胞因子信號轉導的抑制分子，在TLR4識別LPS及轉導信號途徑中發(fā)揮負調控作用，可以下調細胞因子的表達。我們以前的研究表明，沙棘多糖在體外可以促進巨噬細胞的增殖和吞噬細胞活性的增高[7]，但沙棘多糖是否具有保肝功能及其對TLR4和SOCS3這一對作用相反的信號分子是否具有調控作用目前還不清楚。本實驗通過建立LPS/D-GalN 誘導的肝損傷模型研究沙棘多糖的保肝作用，檢測肝臟中TLR4和SOCS3的表達情況分析其作用機制，為保肝新藥的研發(fā)奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑實驗用沙棘產自呼和浩特，沙棘多糖分離純化方法依據(jù)實驗室前期研究成果[9]，C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。實驗環(huán)境：動物房保持通風、干燥、室溫22℃~25℃，濕度50%±5%，12 h/12 h晝夜交替，自由飲水，標準飼養(yǎng)飼料。LPS(L4391)購自Sigma公司，D-GalN(G0500)購自Sigma公司，地塞米松磷酸鹽注射液(國藥H41020055)產自鄭州卓峰制藥有限公司； TLR4和SOCS3抗體購自美國Cell Signaling公司，免疫組化二抗和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Western blot二抗購自LI-COR公司。

1.2動物實驗方法120只8周齡健康C57BL/6小鼠隨機分為6組：正常對照組，肝損傷模型組，地塞米松陽性對照組，沙棘多糖低、中和高劑量組，每組20只小鼠。沙棘多糖低、中、高劑量組分別以50、100和200 mg/kg的沙棘多糖連續(xù)灌胃14 d，其余組以同體積生理鹽水灌胃，末次灌胃后禁食不禁水24 h，然后通過腹腔注射LPS(10 μg/kg)和D-GalN(700 mg/kg)建立急性肝損傷模型，陽性藥物組腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)，正常組只注射同體積生理鹽水。注射后4h時采集各組小鼠的血液和肝臟組織。引頸處死小鼠，摘取肝臟，置于10%中性甲醛中固定，用于HE染色及Western blot分析。

1.3血清中ALT、AST的檢測采集的血液靜置凝固后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，立即檢測。血清中ALT、AST含量通過全自動生化分析儀測定，測定結果由內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科提供。

1.4肝臟病理組織形態(tài)學觀測肝臟組織經石蠟切片、蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)，最后將肝臟組織切片置于400倍光學顯微鏡下，觀測肝小葉結構、肝細胞的結構和形態(tài)、炎性細胞浸潤灶數(shù)量。

1.5Western blot檢測肝臟組織TLR4、SOCS3的表達情況肝臟組織按照重量/體積=1/9的比例加入組織蛋白抽提液，經破碎后4 000 r/min離心10 min即得到10%肝臟組織蛋白勻漿，利用BCA試劑盒方法檢測蛋白含量。經SDS-PAGE電泳分離所需蛋白，濕法轉膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。 5% BSA 封閉1 h后，分別加入TLR4一抗、SOCS3一抗于兩塊PVDF膜，4℃孵育過夜。經TBST分別數(shù)次洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后用Odyssey紅外激光掃描成像儀分別檢測兩種蛋白的表達量，并分析其變化。

2結果

2.1沙棘多糖對血清中ALT、AST的影響血清中的ALT、AST通常被當作急性肝損傷早期的重要生化指標。從ALT和AST檢測結果的統(tǒng)計學分析中可以看出(圖1)，在LPS/D-GalN誘導的肝損傷模型中，4 h時模型組比正常對照組的ALT、AST的活性有顯著升高，說明模型構建成功。同時可以看出沙棘多糖顯著抑制了小鼠血清中ALT和AST活性的上升(P<0.01，P<0.05),并且具有劑量依賴性。

2.2沙棘多糖對肝臟組織病理形態(tài)的影響如肝臟病理組織切片結果所示(圖2)，與對照組相比，LPS/D-GalN誘導的肝損傷模型組肝組織內可見較多的炎性細胞浸潤。地塞米松治療組肝臟組織內極少見炎性浸潤灶。沙棘多糖作用后炎性細胞浸潤灶明顯減少，尤其是在中高劑量組更為明顯。

圖1　沙棘多糖對LPS/D-GalN誘導的肝損傷小鼠血清中ALT、AST的影響Fig.1　Effects of sea buckthorn polysaccharides on serum activities of ALT and AST in LPS/D-GalN induced liver injury miceNote: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose group of sea buckthorn polysacc-harides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysaccharides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2　肝臟組織病理切片(HE染色，×400)Fig.2　Histopathology of liver tissue (HE staining，×400)Note: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose group of sea buckthorn polysacc-harides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysaccharides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides.

圖3　Western blot檢測沙棘多糖對肝組織中TLR4表達的影響Fig.3　Effects of sea buckthorn polysaccharide on hepatic TLR4 expression detected by Western blotNote: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose of sea buckthorn polysaccharides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysaccharides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides.

2.3沙棘多糖對肝臟中TLR4表達的影響TLR4在正常組的小鼠肝臟組織中有少量的本底表達，而模型組中TLR4的表達量顯著增高，沙棘多糖各劑量組小鼠肝臟中TLR4的表達量比模型組都有所降低，且隨沙棘多糖量的增多呈現(xiàn)出逐次降低的趨勢，高劑量組的效果最為明顯 (圖3)。本實驗采用紅外激光掃描成像系統(tǒng)軟件(Odyssey CLX)對TLR4與內參actin的Western blot結果進行光密度比對，從而對TLR4的表達量進行一個相對定量分析，根據(jù)軟件統(tǒng)計結果也可以看出沙棘多糖劑量依賴性地降低了LPS/D-GalN誘導的TLR4的表達(圖4)。

圖4　肝臟組織中TLR4/actin的Western blot檢測結果的相對定量分析Fig.4　Relative and quantitative analysis of hepatic TLR4/actin detected by Western blotNote: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose group of sea buckthorn polysaccharides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysaccharides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides.

圖5　Western blot檢測沙棘多糖對肝臟中SOCS3的影響Fig.5　Effects of sea buckthorn polysaccharide on hepatic SOCS3 expression detected by Western blotNote: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose group of sea buckthorn polysaccharides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysaccharides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides.

圖6　肝臟組織中SOCS3/actin的Western blot檢測結果的相對定量分析Fig.6　Relative and quantitative analysis of hepatic SOCS3/actin detected by Western blotNote: A.Control group；B.Model group；C.Dexamethasone positive control group；D.Low dose group of sea buckthorn polysaccharides；E.Medium dose group of sea buckthorn polysacc-harides；F.High dose group of sea buckthorn polysaccharides.

2.4沙棘多糖對肝臟中SOCS3表達的影響通過實驗結果可以看出(圖5和圖6)，正常組的小鼠肝臟中SOCS3基本沒有表達，模型組SOCS3誘導性增高，地塞米松組和沙棘多糖各劑量組中SOCS3的表達量與模型組相比沒有明顯差別。由此可知沙棘多糖可能對SOCS3的表達沒有影響。

3討論

LPS作為內毒素，可引起體內天然免疫系統(tǒng)的激活，產生大量促炎性因子，這些炎性因子可引起一系列炎癥反應，它們的過量表達與肝損傷和肝細胞壞死有著密不可分的關系，D-GalN的作用是消耗肝細胞內的磷酸尿嘧啶核苷酸使細胞處于異常狀態(tài)，成倍放大LPS的效應[8]。地塞米松是一種糖皮質激素，有文獻顯示其可以有效抑制TLR4信號通路抑制促炎性因子的合成，保護肝細胞[9]，所以選用地塞米松作為實驗的陽性對照藥物。實驗研究表明，LPS/D-GalN共同作用會引起小鼠肝臟強烈的炎癥反應，從而引起肝細胞彌漫性變性、壞死、炎癥細胞的浸潤等。因此本實驗通過LPS/D-GalN共同作用誘導小鼠急性肝損傷來模擬肝炎的發(fā)生。

采用HE染色檢測沙棘多糖對肝臟組織病理切片的影響，同時結合ALT和AST兩項指標的檢測結果探究沙棘多糖對肝損傷小鼠肝臟組織的保護作用。LPS在機體內與其結合蛋白相結合成一種可溶性復合體，直接與細胞表面受體TLR4結合，通過TLR4信號通路跨膜傳導至胞漿中激活NF-κB信號通路，又通過活化的NF-κB進入核內，激活促炎性因子的轉錄翻譯，誘發(fā)大量促炎性因子的合成；SOCS3是一種細胞因子信號傳導抑制分子，在TLR4識別LPS及轉導信號途徑中發(fā)揮負調控作用，抑制NF-κB通路，下調細胞因子的表達。本實驗通過Western blot檢測肝損傷小鼠肝臟組織中TLR4和SOCS3的表達量來進一步探索沙棘多糖對肝臟的保護作用機制。

我們的研究結果顯示，沙棘多糖劑量依賴性地降低了TLR4的表達。文獻報道顯示，TLR4的表達量與肝損傷程度呈正相關[10]，說明沙棘多糖通過抑制TLR4的表達發(fā)揮保肝作用。對TLR4信號通路負調控因子SOCS3進一步檢測發(fā)現(xiàn)，其在各組的表達量無明顯變化，說明沙棘多糖對SOCS3的表達無影響，因此我們推測沙棘多糖可能通過抑制TLR4信號通路抑制促炎性因子表達，從而發(fā)揮保肝作用，這一保護作用并非通過調控SOCS3的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，可以認為沙棘多糖具有良好的抗炎作用，可以有效緩解LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷，達到保護肝臟的效果。沙棘多糖的天然免疫調節(jié)機制可能是通過調節(jié)TLR4信號通路來實現(xiàn)的。

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[收稿2015-03-21修回2015-06-24]

(編輯許四平)