熒光增強(qiáng)型量子點(diǎn)探針檢測痕量谷氨酸脫氫酶

楊敏+余濤+張忠平+王素華+蔣輝

摘 要 建立了熒光增強(qiáng)型量子點(diǎn)探針檢測痕量谷氨酸脫氫酶（GLDH）的方法， GLDH是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的酶分子，具有氧化性的NAD+通過電子轉(zhuǎn)移淬滅CdTe量子點(diǎn)的熒光，而GLDH催化的生物化學(xué)反應(yīng)可以消耗NAD+。 在所采用的NAD+/GLDH體系中，量子點(diǎn)的熒光先被NAD+淬滅，加入GLDH消耗NAD+，熒光會(huì)因NAD+的減少而增強(qiáng)。利用這種高選擇性的酶促反應(yīng)可以檢測濃度范圍比較寬的GLDH（10～1000 U/L）。對于這個(gè)濃度范圍GLDH的檢測在臨床上有重要意義，可用于診斷不同類型的肝臟疾病。

關(guān)鍵詞 熒光分析法； 量子點(diǎn)； 谷氨酸脫氫酶； NAD； 肝損傷

1 引 言

基于半導(dǎo)體納米顆粒的量子點(diǎn)因其獨(dú)特的電子性質(zhì)和光學(xué)特性已被用于許多領(lǐng)域的研究中[1，2]，其具有較寬的吸收光譜、較窄的發(fā)射譜帶和抗光漂白特性。這些優(yōu)點(diǎn)使其適用于生物學(xué)的研究，例如體外成像[3～7]、體內(nèi)跟蹤[8，9]，生物分析[9]和生物傳感器的研究[10，11]。 近年來，已有多種基于熒光分子探針和量子點(diǎn)的生物傳感器用于不同分析物的檢測，如檢測金屬離子（Ag+， Cu2+， Pb2+）、活性小分子（NO和HClO）、生物活性大分子（DNA、蛋白質(zhì)、酶）等[12～19]。

本研究利用CdTe量子點(diǎn)檢測谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH）。GLDH是線粒體酶，存在于所有組織的細(xì)胞中，其中以肝臟細(xì)胞線粒體內(nèi)的GLDH活性最高，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損害時(shí)，GLDH會(huì)進(jìn)入血液，因此臨床上通過測定血清GLDH的含量作為診斷肝細(xì)胞損傷病變的指標(biāo)分子[20]。同其它用于診斷肝疾病的標(biāo)記分子，如ALT， AST， SDH， ALP[21，22]相比，GLDH的特異性更高，肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)GLDH上升量更多，因此對肝細(xì)胞損傷的診斷更為靈敏[23]?，F(xiàn)有的用于檢測GLDH的方法有比色法、分光光度法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。這些方法存在靈敏度低、假陽性等缺陷。基于增強(qiáng)型熒光體系的分析方法主要基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移兩種機(jī)理，其靈敏度高、干擾少，因此是檢測多肽和酶等生物分子的有效技術(shù)[24]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Perkin Elmer LS 55熒光光譜儀測定（美國PE公司）。Shimadzu UV 2550光譜儀（日本島津公司）。

3 巰基丙酸（3 Mercaptopropionic acid， MPA）和谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH，type II）購自Sigma公司；碲粉（Tellurium）、L谷氨酸（Lglutamate）、NaHB4、CdCl2·2.5H2O（國藥集團(tuán)化學(xué)公司）。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+，上海生工有限公司）。所有試劑都是分析純，未經(jīng)純化直接使用。超純水（18.2 MΩ

SymbolWC@ cm）來自于Millipore純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

MPA CdTe量子點(diǎn)是通過對文獻(xiàn)＼[25] 的方法改進(jìn)合成得到的。將0.0319 g碲粉和0.05 g NaHB4加入到通N2保護(hù)的超純水中，形成黑色的混合液，混合液在冰浴中攪拌直至液體澄清；將0.2284 g CdCl2·2.5H2O和0.21 mL 3 巰基丙酸（MPA）溶解在超純水中，用NaOH將溶液調(diào)至pH=9，溶液通入N2除O2；向碲粉和NaHB4的混合液中加入適量0.5 mol/L H2SO4，產(chǎn)生白色的H2Te氣體，將H2Te氣體通入到CdCl2

SymbolWC@ 溶液中，攪拌20 min，通過控制回流時(shí)間可以得到不同尺寸的CdTe量子點(diǎn)?；亓骷s1 h就得到綠色的CdTe量子點(diǎn)。制備好的量子點(diǎn)用丙酮進(jìn)行純化。

檢測過程如下： 首先將8 μL 綠色量子點(diǎn)溶解在2 mL超純水中，混勻后測量其熒光強(qiáng)度，記錄為I0。加入不同濃度的NAD+（0～14.71 μmol/L）， 10 min后，測量混合液的熒光強(qiáng)度，記錄為I， 從而得到量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度猝滅不同百分比所需要的NAD+濃度。GLDH的檢測順序：根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，確定輔因子NAD+的固定用量，并與相同量的底物L(fēng)谷氨酸混合，再加入不同量的GLDH，在25 ℃水浴下反應(yīng)10 min。 將反應(yīng)混合液分別加入到CdTe量子點(diǎn)溶液中，5 min后測量熒光強(qiáng)度，記錄為Ij （j表示谷氨酸脫氫酶（GLDH）的濃度，j=0， 10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。所有的熒光光譜都用400 nm波長激發(fā)，掃描范圍為450～650 nm，掃描速度為500 nm/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 NAD+對MPA CdTe量子點(diǎn)熒光的淬滅

NAD+可以通過電子轉(zhuǎn)移途徑有效淬滅量子點(diǎn)的熒光。NAD+對量子點(diǎn)熒光的淬滅隨著時(shí)間的變化關(guān)系見圖1。NAD+的加入會(huì)引起CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的降低，隨著作用時(shí)間的增長，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度也會(huì)逐漸減弱。10 min后，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度會(huì)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值。不同濃度的NAD+引起的CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的變化見圖2，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨著NAD+的濃度的增加而降低。圖中的插圖為量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的比值I/I0（I是加入NAD+后量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，I0是量子點(diǎn)的初始熒光值）與NAD+濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NAD+可以淬滅MPA CdTe的熒光，基于這個(gè)現(xiàn)象，可以采用量子點(diǎn)來檢測GLDH。

3.2 熒光檢測GLDH

GLDH以NAD+為輔酶，在體內(nèi)催化谷氨酸生成α酮戊二酸的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。將GLDH與L谷氨酸加入到含有NAD+的溶液中，NAD+會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而被消耗，氧化態(tài)的NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)的NADH。如體系中預(yù)先加入了CdTe量子點(diǎn)，NAD+的減少會(huì)使之前被NAD+淬滅的CdTe量子點(diǎn)的熒光增強(qiáng)?；诖?，設(shè)計(jì)了一種光學(xué)檢測體系用于GLDH的檢測。圖3為量子點(diǎn)檢測GLDH的實(shí)驗(yàn)原理。研究表明，NAD+在磷酸鹽緩沖體系中不能發(fā)揮其淬滅CdTe量子點(diǎn)熒光的作用。圖4是以pH 7.2的磷酸鹽緩沖液作為溶劑，NAD+對CdTe量子點(diǎn)熒光的淬滅。從圖4可見，CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度基本不發(fā)生變化。為了證明NAD+在磷酸鹽緩沖液中是否發(fā)生分解，從而影響其對量子點(diǎn)熒光的淬滅作用，對比了分別用超純水和磷酸鹽緩沖液作為溶劑時(shí)NAD+的紫外 可見吸收光譜。圖5中實(shí)線為NAD+在超純水中的吸收譜圖，虛線為NAD+在磷酸鹽緩沖液中的吸收譜圖。兩條線是重合的，由此得出，NAD+在磷酸鹽緩沖液中并沒有發(fā)生分解。

為了解決上述問題，設(shè)計(jì)了兩步法，將酶催化反應(yīng)和熒光檢測過程分別進(jìn)行。第一步是GLDH酶的催化反應(yīng)，將底物L(fēng)谷氨酸、輔因子NAD+，及不同量的GLDH混合在PCR管中反應(yīng)；第二步是將上述混合物分別加入到含有CdTe量子點(diǎn)的溶液中，混合5 min后，記錄量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度為Ij，量子點(diǎn)的初始熒光值被記錄為Ii（i，j= 0，10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。圖6展示了不同的GLDH對CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的恢復(fù)情況。在低濃度的GLDH時(shí)，因?yàn)橹挥猩倭縉AD+會(huì)因?yàn)镚LDH的酶催化反應(yīng)被消耗，所以量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)的程度很微弱。隨著GLDH的增加，NAD+的量大大減少，量子點(diǎn)的熒光逐步恢復(fù)到初始強(qiáng)度。圖6插圖是反應(yīng)產(chǎn)物加入前后量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的比值同GLDH濃度的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)檢測的GLDH濃度范圍為10～1000 U/L，這個(gè)區(qū)間在醫(yī)學(xué)診斷上有重要的應(yīng)用，可以根據(jù)GLDH濃度區(qū)分不同類型的肝損疾病。

從圖6可見，隨著GLDH濃度增加，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而且超出了初始值。實(shí)驗(yàn)表明，GLDH本身也可以增強(qiáng)量子點(diǎn)的熒光，如圖7所示。單獨(dú)加入100 U/L GLDH會(huì)增加CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，增強(qiáng)幅度接近2倍（I/I0=2，I0和I分別為加入GLDH前后的量子點(diǎn)熒光值）。而在酶促反應(yīng)體系中，加入100 U/L GLDH、NAD+、谷氨酸，得到的I/I0=0.96，只約為單獨(dú)GLDH增強(qiáng)作用1/2。這說明GLDH優(yōu)先與NAD+發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致被NAD+猝滅的量子點(diǎn)熒光得到大部分的恢復(fù)，但低濃度的GLDH酶表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)作用。在酶促反應(yīng)檢測體系中，GLDH主要用于催化谷氨酸的脫氨反應(yīng)而消耗NAD+，繼續(xù)增加GLDH的含量，直至NAD+被反應(yīng)消耗完全，酶催化反應(yīng)結(jié)束，多余的GLDH進(jìn)一步增強(qiáng)量子點(diǎn)的熒光，在采用高濃度的GLDH時(shí)，其熒光增強(qiáng)作用表現(xiàn)的比較明顯，這與本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象吻合。

采用NAD+/GLDH體系，將量子點(diǎn)的獨(dú)特的光學(xué)特性和酶的特異性、高效性相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對GLDH簡單、快速的檢測。GLDH作為肝損傷的重要指標(biāo)分子，在診斷不同的肝臟疾病中有重要的應(yīng)用。本檢測方法可以實(shí)現(xiàn)對GLDH較大濃度區(qū)間（10～1000 U/L）的測定，在臨床中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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