GC-MS/MS測(cè)定不同食品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯的含量

周佳，成長(zhǎng)玉，郭慶，陳祥貴

（1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川成都 611731；2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039）

氨基甲酸甲酯（Methy Carbamate，MC）及氨基甲酸乙酯（Ehthy Carbamate，EC）是在食品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種發(fā)酵副產(chǎn)物，廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料中[1-3]。早在上世紀(jì)六七十年代，就已經(jīng)證實(shí)兩種化合物均能誘發(fā)良性或惡性腫瘤，特別是肺癌和肝癌[4]，到近二十年有可信數(shù)據(jù)顯示，其在一般食品中含量較低，而發(fā)酵食品中含量較高。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on cancer，IARC）已將氨基甲酸乙酯認(rèn)定為2A級(jí)致癌物[5]，鑒于其對(duì)人類具有潛在的致癌性，氨基甲酸乙酯含量已成為近年來(lái)國(guó)際社會(huì)高度關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題之一。特別是隨著居民生活水平提高，對(duì)發(fā)酵食品消費(fèi)量不斷增加，氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯對(duì)健康可能存在一定安全隱患?，F(xiàn)行國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.223-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》[6]中對(duì)氨基甲酸乙酯含量測(cè)定的方法，只適用于液體基質(zhì)，沒(méi)有對(duì)固體基質(zhì)的測(cè)定方法，并且方法采用GC-MS的選擇離子監(jiān)測(cè)模式（Selected Ion Monitoring，SIM），干擾很大，腐乳、豆豉等復(fù)雜基質(zhì)用GC-MS（SIM模式）常常無(wú)法定性。另一方面，氨基甲酸甲酯的測(cè)定在行業(yè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中是一片空白，查閱文獻(xiàn)，雖然被廣泛承認(rèn)其對(duì)人體的危害性，但現(xiàn)階段只看到少量報(bào)道用液相或氣相-質(zhì)譜（SIM模式）測(cè)定白酒中的氨基甲酸甲酯[7-8]，對(duì)其他發(fā)酵食品中氨基甲酸甲酯含量測(cè)定方法則未見(jiàn)報(bào)道。我國(guó)目前還未明確MC及EC在食品中的限量，制定穩(wěn)定的檢測(cè)方法很有必要，方便了解我國(guó)發(fā)酵食品中MC及EC的含量水平，為制定相應(yīng)的限量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

腐乳、豆豉、發(fā)酵乳、料酒、醬油、醋、白酒：市售。

1.2 主要儀器

Agilent 7890A/7000b GC-MS/MS三重四級(jí)桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：安捷倫科技有限公司；Sartorius CPA225D電子天平；德國(guó)賽多利斯茵泰科公司；Milli-Q超純水儀；美國(guó)Millipore公司；AS10200A型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 試劑

甲醇：Merck公司；乙酸乙酯、乙醚、正己烷、氯化鈉：成都市科隆化工試劑廠；硅藻土固相萃取柱（1 000 mg/6 mL及2 000 mg/12 mL）：天津博納艾科技有限公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

氨基甲酸乙酯：Dr.Ehrenstorfer GmbH；氨基甲酸甲酯：北京百靈威科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯：CDN ISOTOPES。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

2.1.1 目標(biāo)物使用液的配制

精密稱定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯對(duì)照品適量，分別置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至各量瓶中，得單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成混合對(duì)照品中間液。（氨基甲酸甲酯濃度為2.0 μg/mL、氨基甲酸乙酯濃度為 1.0 μg/mL）。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)使用液的配制

精密稱定D5-氨基甲酸乙酯對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容置容量瓶中，得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取D5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成約2 μg/mL內(nèi)標(biāo)中間液。

2.1.3 基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液

將經(jīng)過(guò)測(cè)定不含有被測(cè)目標(biāo)物的同基質(zhì)物質(zhì)作為空白樣品，照樣品前處理項(xiàng)下（不加內(nèi)標(biāo)使用液）制備空白樣品基質(zhì)溶液。精密吸取適量混合對(duì)照品中間液，各加入內(nèi)標(biāo)中間液100 μL，40℃以下氮吹至近干，加入空白樣品基質(zhì)溶液各1 mL，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2.2 樣品前處理

2.2.1 液體基質(zhì)

液體基質(zhì)（包括料酒、醬油、醋、白酒）樣品搖勻，稱取 1 g（精確至 0.001 g）樣品，加入 100 μL 內(nèi)標(biāo)中間液（約 2 μg/mL），加入氯化鈉 0.3 g（醬油可不加），渦旋混勻，超聲5 min，使溶解，混勻，將樣品全部轉(zhuǎn)移至SPE小柱（Agela cleanert SLE-SPE，1 000 mg/6 mL）上，靜置10 min，用10 mL正己烷淋洗后，用10 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5）洗脫，收集洗脫液，洗脫液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供試液。

2.2.2 固體基質(zhì)

固體及半固體基質(zhì)（腐乳、豆豉、發(fā)酵乳）樣品混勻（腐乳需用研缽研成糊狀），稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加入 500 μL 內(nèi)標(biāo)中間液（約 2 μg/mL）、氯化鈉1.0 g，精密加入超純水10 mL，渦旋混勻，超聲20 min，使充分混勻，離心，濾過(guò)，精密量取濾液2 mL至SPE（Agela cleanert SLE-SPE，2 000 mg/12 mL）上，靜置10 min，用20 mL正己烷淋洗后，用20 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5，體積比）洗脫，收集洗脫液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供試液。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：毛細(xì)管色譜柱，DB-INNOWAX，30 m×0.25 mm（內(nèi)徑）×0.25 μm（膜厚）；進(jìn)樣口溫度：220℃；進(jìn)樣方式：脈沖不分流；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：80 ℃保持2 min，以10℃/min至180℃保持3 min，240℃后運(yùn)行6 min；流速 1.0 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件

載氣：氦氣；碰撞氣：氮?dú)?；離子源：電子轟擊離子源（EI）；電子能量：70 eV，四級(jí)桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式；溶劑延遲：6.5 min。檢測(cè)化合物離子參數(shù)見(jiàn)表1，對(duì)照品及樣品（腐乳）總離子流圖見(jiàn)圖1，各化合物提取離子流圖見(jiàn)圖2。

表1 檢測(cè)化合物離子參數(shù)Table 1 Ion parameters of target compound

圖1 氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯對(duì)照品及樣品（腐乳）總離子圖Fig.1 Total ion chromatograms of methyl carbamate and ethyl carbamate

圖2 各化合物提取離子流圖Fig.2 Ion flow diagrams of various compounds

2.4 線性關(guān)系及檢測(cè)下限考察

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品中間液適量，用甲醇稀釋成系列混合對(duì)照品溶液（每個(gè)化合物至少測(cè)定5個(gè)濃度水平），照上述方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。同時(shí)以信噪比（S/N）為3∶1及10∶1為基準(zhǔn)分別測(cè)定各化合物的檢出限及定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 MC及EC的回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Regression equaion，linear ranges，limit of detection and limit of quantitation of the determination method for methyl carbamate and ethyl carbamate

結(jié)果表明各化合物在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，氨基甲酸甲酯檢出限在6 ng/mL，線性范圍為20 ng/mL～1 000 ng/mL，氨基甲酸乙酯檢出限在3ng/mL，線性范圍為 10 ng/mL～500 ng/mL。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、48h進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積。結(jié)果各時(shí)間段氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯峰面積的RSD%分別為3.01%、0.57%，表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

2.6.1 液體基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定含量的樣品（共9份，分別精密加入低、中、高3個(gè)水平的混合對(duì)照品中間液，每份濃度3份），加入內(nèi)標(biāo)中間液 100 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下制備加標(biāo)回收率測(cè)定樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各化合物的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 MC及EC在液體基質(zhì)中（料酒）的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 3 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in fluid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在75.83%～80.31%，RSD%小于3.04%，氨基甲酸乙酯回收率在99.80%～100.52%，RSD%小于2.03%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.6.2 固體基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取用研缽研成糊狀的樣品（腐乳共9份，分別精密加入低、中、高3個(gè)水平的混合對(duì)照品溶液，每份濃度 3 份），加入內(nèi)標(biāo)中間液 500 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下制備加標(biāo)回收率測(cè)定樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各化合物的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 MC及EC在固體半固體基質(zhì)中（腐乳）的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 4 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in solid and semisolid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在60.28%～65.72%，RSD%小于3.22%，氨基甲酸乙酯回收率在99.86%～101.34%，RSD%小于2.44%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.7 各類食品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量

取各樣品（液體基質(zhì)約1.0 g，固體基質(zhì)約5.0 g），精密稱定，液體基質(zhì)按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，固體基質(zhì)按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，以D5-氨基甲酸乙酯為內(nèi)標(biāo)計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各類發(fā)酵食物中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量Table 5 The content of methyl carbamate and ethyl carbamate in various types of fermented food

3 結(jié)論

1）現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中只有針對(duì)液體基質(zhì)中氨基甲酸乙酯的測(cè)定方法，沒(méi)有針對(duì)如腐乳、豆豉、酸奶這種固體及半固體基質(zhì)的方法，本文建立了固體及半固體基質(zhì)的前處理方法。

2）氨基甲酸甲酯（MC）及氨基甲酸乙酯（EC）均屬于微量檢測(cè)，由于其分子量均較?。∕C：75；EC：89），碎片離子易被干擾，文獻(xiàn)報(bào)道中測(cè)定氨基甲酸乙酯方法多使用GC-MS（SIM模式），單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]，常常無(wú)法定性，復(fù)雜的基質(zhì)（如腐乳、豆豉）表現(xiàn)得尤為突出，腐乳中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯干擾圖見(jiàn)圖3、圖4；本法采用GC-MS/MS（MRM模式）可以有效減少雜質(zhì)的干擾，提高靈敏度。

圖3 腐乳基質(zhì)中氨基甲酸甲酯SIM模式及MRM模式對(duì)比圖Fig.3 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing methyl carbamate in fermented bean curd

圖4 腐乳基質(zhì)中氨基甲酸乙酯SIM模式及MRM模式對(duì)比圖Fig.4 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing ethyl carbamate in fermented bean curd

3）氨基甲酸乙酯（EC）為多位點(diǎn)致癌物，其危害性已得到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，其相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告較多，氨基甲酸甲酯（MC）與氨基甲酸乙酯（EC）一樣，同為食品發(fā)酵副產(chǎn)物，現(xiàn)今鮮少被報(bào)告，發(fā)酵食品中MC殘留的多少，尚待進(jìn)一步調(diào)查和分析，本文首次建立GC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定不同基質(zhì)中同時(shí)測(cè)定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量的方法，對(duì)關(guān)注食品安全與人體健康有極其重要的意義。

4）此方法關(guān)鍵步驟是收集洗脫液后氮吹，考察樣品分別用 20、30、40、50、60 ℃氮吹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 40 ℃以下氮吹峰面積較穩(wěn)定（見(jiàn)圖5）；雖然本文采用內(nèi)標(biāo)法，峰面積有一定損失也可以對(duì)含量進(jìn)行校正，但若樣品含量較低時(shí)，氮吹溫度過(guò)高，樣品將檢測(cè)不到含量，影響較大，綜合考慮以后選擇40℃以下氮吹。

圖5 氮吹溫度考察Fig.5 Investigation of the nitrogen blowing temperation

5）洗脫液含95%的乙醚，很容易便被吹干，如若吹干，將測(cè)量不到樣品中氨基甲酸乙酯及氨基甲酸甲酯的含量，因此，此試驗(yàn)切忌不能將樣品吹干，否則無(wú)法檢測(cè)到樣品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯的含量。

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