去除二硫鍵和蛋白殘基對銀杏抗菌蛋白構(gòu)象的影響

史曉璇，陳 洪

（中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

去除二硫鍵和蛋白殘基對銀杏抗菌蛋白構(gòu)象的影響

史曉璇，陳 洪

（中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

通過分子動力學(xué)模擬，研究了二硫鍵以及蛋白自身殘基在維持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定中起到的作用，對野生型、截斷型和突變型的銀杏抗菌蛋白Ginkbilobin-2（Gnk-2）的構(gòu)象變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：在100 ns的模擬時間內(nèi)，造成蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因，是蛋白自身殘基的缺失，而短時間內(nèi)二硫鍵在維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面的作用并不明顯。僅通過比較短時間內(nèi)模擬所得到的截斷型和野生型蛋白的結(jié)構(gòu)變化無法判斷二硫鍵對蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。這與文獻(xiàn)中僅通過100 ns的時間內(nèi)模擬野生型和截斷型蛋白均方根位移（RMSD）值的變化趨勢，便判斷出二硫鍵的斷裂是引發(fā)蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因的看法，是不一致的。這些結(jié)果對揭示二硫鍵以及蛋白自身殘基在維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象及其生物活性中所起的作用具有重要的意義。并且對銀杏抗菌蛋白的深入研究和開發(fā)也提供了理論支持。

分子動力學(xué)模擬；二硫鍵；蛋白自身殘基；銀杏抗菌蛋白；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

抗菌蛋白可以有效降低病原菌對農(nóng)作物的危害，避免農(nóng)作物生產(chǎn)遭受巨大損失。因此，近年來利用生物技術(shù)研究抗菌蛋白成為了研究的熱點。銀杏Ginkgo biloba起源古老，壽命可達(dá)3 000年以上，被稱為植物“活化石”。自然界的銀杏樹幾乎不會感染疾病，銀杏的抗菌能力吸引了許多學(xué)者的研究[1-10]。銀杏抗菌蛋白Ginkbilobin-2(Gnk-2)是銀杏種子的胚乳中發(fā)現(xiàn)的一種新型抗菌蛋白，是一種含有108個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，可以抑制植物病原真菌如尖孢鐮刀菌的生長[11]。Gnk-2蛋白中含有三個二硫鍵，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面有重要的作用。

一般而言，二硫鍵，同時也可被稱作二硫橋，是一種在蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及聚集性方面有重要作用的共價鍵。二硫鍵是2個-SH基被氧化而形成的—S—S—形式的硫原子間的鍵。在生物化學(xué)的領(lǐng)域中，通常是指在肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵。巰基之間想要形成二硫鍵必須要包含以下三個要素：可及性，相互鄰近，可以相互反應(yīng)[12-14]。關(guān)于半胱氨酸形成二硫鍵的條件，Creighton[15]就立體化學(xué)方面提出了三點準(zhǔn)則：(1)硫原子之間的距離為2.05±0.03?，(2) 形成二硫鍵的硫原子與β-carbon原子間的角度接近103°，(3) 兩個β-carbon原子的方向與二硫鍵旋轉(zhuǎn)±90°后的方向一致。兩個硫原子相互作用的能量大約為300-430 kJ/mol[14]，因此這種相互作用的缺失會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生顯著的構(gòu)象變化。二硫鍵在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及功能方面的作用各不相同。關(guān)于二硫鍵在不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性能方面的作用，學(xué)者也已經(jīng)在一系列實驗[16-20]和模擬計算[21-28]中開展了相關(guān)研究。而為研究去除二硫鍵會導(dǎo)致蛋白構(gòu)象所發(fā)生的變化，前人也已經(jīng)陸續(xù)得到了一些實驗結(jié)果[16-18]：二硫鍵的去除會降低蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，也會擾亂和減弱蛋白局部區(qū)域的活動。

二硫鍵的改性需要極端嚴(yán)苛的實驗條件以及先進(jìn)的實驗技術(shù)[29]，尤其是在避免蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)以及極性的沖突方面。而分子動力學(xué)模擬的方法可以較容易改性蛋白質(zhì)并觀測蛋白結(jié)構(gòu)和動力學(xué)特性的變化。目前為止，分子動力學(xué)模擬的方法已經(jīng)被用于研究各種蛋白的結(jié)構(gòu)特性[26-28]。在分子動力學(xué)模擬的過程中，研究人員通常通過去除形成二硫鍵的半胱氨酸殘基的方式來達(dá)到去除二硫鍵的目的，得到截斷型蛋白[26-28]。2006年，Qin Meng等[25]研究了淀粉酶抑肽Tendamistat中的二硫鍵的折疊作用，模擬結(jié)果表明二硫鍵以及氫鍵對于蛋白的折疊至關(guān)重要，在去除二硫鍵的情況下，蛋白的穩(wěn)定性大大降低。Moghaddam等學(xué)者[26]利用分子動力學(xué)模擬研究了二硫鍵在蝎毒素scorpion toxin Lqh III 1000 ps內(nèi)的作用。模擬結(jié)果表明，二硫鍵雖然不是強化自身位置結(jié)構(gòu)最重要的影響因素，但是二硫鍵在整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中起到了重要的作用。2012年，Castellanos等[27]研究了二硫鍵在人體血清蛋白Human Serum Albumin(HSA)中所起到的作用。他們認(rèn)為70 ns之中的去除二硫鍵的HSA結(jié)構(gòu)變化是來源于二硫鍵的缺失。同樣，2014年Ning LuLu等學(xué)者[28]在朊病毒蛋白Prion Protein中，針對特定的二硫鍵 Cys179-Cys214進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬研究。在100 ns的模擬中，作者將變異型和截斷型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化直接歸因于二硫鍵的缺失，認(rèn)為二硫鍵對蛋白穩(wěn)定性有重要的作用。然而，通過此種方式得到的截斷型蛋白的構(gòu)象變化將不可以再單一的歸結(jié)為是二硫鍵的去除。因為二硫鍵的去除同時也會造成蛋白質(zhì)自身殘基的缺失，蛋白自身殘基的缺失同樣會對蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性造成一定的影響。

因此，本研究的主要目的就是以含三個二硫鍵的銀杏抗菌蛋白Gnk-2為例，通過分子動力學(xué)模擬來探究短時間（100 ns）內(nèi)造成蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化、影響蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性的主要原因究竟是蛋白自身殘基的缺失還是二硫鍵的去除。這從分子水平上揭示二硫鍵以及蛋白自身殘基對蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性的影響機制具有重要的理論意義。同時，通過對影響Gnk-2蛋白質(zhì)因素的研究，可以為轉(zhuǎn)基因抗病種的獲得以及生物制藥抗生素的研制提供基礎(chǔ)的理論。

1 模型與方法

1.1 抗菌蛋白Gnk-2模型

采用PDB數(shù)據(jù)庫中編號為3A2E的銀杏抗菌蛋白分子為模型蛋白，刪除四聚體中的其他原子，得到抗菌蛋白單體，如圖1所示。野生型Gnk-2的三級結(jié)構(gòu)是由兩個α-helix和一個 five-stranded β-sheet構(gòu)成的，形成了一個緊湊的單體結(jié)構(gòu)[30]。在β-sheet中，折疊的順序從一頭到另一頭是1-4-5-3-2.所有的折疊呈現(xiàn)反平行的方向。野生型Gnk-2蛋白的半胱氨酸殘基形成了三個分子內(nèi)的二硫鍵，這三個二硫鍵分別是：Cys10-Cys86，Cys62-Cys71，和Cys74-Cys99。這三個二硫鍵是在H2 helix和三個β-sheet之間形成的（S1，S3和S5），Gnk-2的結(jié)構(gòu)以及二硫鍵Cys10-Cys86, Cys62-Cys71,和 Cys74-Cys99在其中的分布如圖1所示。

圖1 抗菌蛋白Gnk-2模型中的三個二硫鍵Fig.1 Three disul fide bonds in Gnk-2 protein

分子動力學(xué)模擬過程中用到的截斷型蛋白是通過建模的方法去除野生型蛋白的某個殘基所得，突變型蛋白是把野生型蛋白的半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢谩?/p>

1.2 分子動力學(xué)模擬方法

文章中所有的分子動力學(xué)模擬都是使用了GROMACS4.6和AMBER99力場。模擬中使用的方法和條件的設(shè)置借鑒了以前的工作[27-28]。模擬系統(tǒng)的水箱設(shè)置要避免邊界效應(yīng)，分子系統(tǒng)到水箱邊界的距離至少1 nm。為了模擬真實的系統(tǒng)，水箱中添加了溶劑和合適濃度的離子，并且添加反電荷的離子以保證系統(tǒng)的電中性。由于溫度的升高可以加速蛋白質(zhì)構(gòu)象變化而不影響蛋白結(jié)構(gòu)變化的路徑，為了在合理的時間內(nèi)觀察到蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，模擬溫度選定為360 K。這樣，既可以合理加速構(gòu)象變化的過程又不至于對蛋白構(gòu)象造成破壞[31-32]。所有的分子動力學(xué)模擬的溫度設(shè)定為360 K，壓強設(shè)定為1 bar，pH值設(shè)定為7.0。時間步長設(shè)定為2 fs，輸出數(shù)據(jù)設(shè)定為每5步更新一次?；瘜W(xué)鍵的設(shè)定使用了LINCS算法[33]。范德瓦爾斯力的截斷長度和短程靜電相互作用半徑都設(shè)置為1 nm。Particle Mesh Ewald (PME)[34]被用來計算長程靜電相互作用。Velocity-rescaling 算法[35]被用來控制溫度，Berendsen算法[36]用于控制壓強。能量最小化使用了 steepest descent method，模擬于50 000 步內(nèi)完成。

系統(tǒng)在動力學(xué)模擬之前，分別做了10 000步的能量最小化以及時長為100 ps的NVT松弛和100 ps的NPT松弛。系統(tǒng)動力學(xué)模擬結(jié)束后所得到的分子運動軌跡的分析，查看以及蛋白分子微觀構(gòu)象圖的制作均使用VMD 1.9.1[37]完成。

1.3 分析方法

蛋白的均方根位移D（root mean square deviation）計算如下：以晶體結(jié)構(gòu)為參照，根據(jù)式(1)計算t時刻的構(gòu)象中各原子坐標(biāo)與天然構(gòu)象中對應(yīng)坐標(biāo)的均方根偏差

式中mi為各原子的原子量，M為各原子的原子量之和，ri(t)和ri(0)分別表示原子i在t時刻和0時刻的位置坐標(biāo)。D的值反應(yīng)了特定構(gòu)象與天然結(jié)構(gòu)的相似程度，其值越低，表明蛋白越接近天然構(gòu)象，反之，則代表差異越大。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生型，截斷型和突變型Gnk-2的構(gòu)象穩(wěn)定性

為了了解二硫鍵以及蛋白自身殘基在銀杏抗菌蛋白Gnk-2的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中所起到的作用，我們采用分子動力學(xué)模擬的方法，研究了100 ns內(nèi)野生型、截斷型和突變型Gnk-2的構(gòu)象變化，并計算出了模擬過程中Gnk-2蛋白主鏈的均方根偏差。

2.1 分子內(nèi)二硫鍵斷裂的截斷型Gnk-2

圖2(a)給出了360 K的情況下，野生型和74截斷型Gnk-2整體結(jié)構(gòu)D的變化。其中74截斷型Gnk-2是去除野生型Gnk-2中74位置上的半胱氨酸殘基后模擬所得，分子內(nèi)二硫鍵Cys74-Cys99遭到破壞。圖中可以看出：(1) 在100 ns的模擬時間內(nèi)，野生型和74截斷型Gnk-2的D值較模擬起始階段均有所升高，即在水溶液的環(huán)境中，野生型和74截斷型Gnk-2的整體結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化。這源于高溫下，銀杏抗菌蛋白Gnk-2分子結(jié)構(gòu)的熱漲落和水分子對Gnk-2的攻擊。(2)野生型Gnk-2的D值在模擬后期穩(wěn)定在0.2 nm之下，而74截斷型Gnk-2的D值在模擬后期達(dá)到0.3 nm之上。即野生型Gnk-2在模擬過程中的D值相對較低，而74截斷型Gnk-2在模擬過程中的D值相對較高，變化顯著。這說明野生型Gnk-2的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著高于74截斷型Gnk-2，也就是說由于74截斷型Gnk-2中，74位置上半胱氨酸殘基的缺失，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生了顯著變化。

74位置上半胱氨酸殘基的缺失會對蛋白構(gòu)象的變化產(chǎn)生兩方面的影響，第一，半胱氨酸殘基缺失所導(dǎo)致的Gnk-2分子內(nèi)二硫鍵Cys74-Cys99的破壞，會對蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，第二，半胱氨酸殘基的缺失使蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix自身構(gòu)象發(fā)生變化，這也會對蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。這兩方面的影響均有可能使74截斷型Gnk-2的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生失穩(wěn)，導(dǎo)致模擬過程中D值的增大。為了探究影響蛋白構(gòu)象變化的主要原因，我們對模擬軌跡做了進(jìn)一步的分析。

圖2(b)給出了360 K的情況下，截斷型銀杏抗菌蛋白Gnk-2整體結(jié)構(gòu)的D值與該蛋白Gnk-2二級結(jié)構(gòu)H2 helix的D值的變化。結(jié)果表明，在100 ns的模擬時間內(nèi)，截斷型銀杏抗菌蛋白Gnk-2整體結(jié)構(gòu)的D值的變化與該蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix的D值的變化趨勢基本一致：與模擬起始狀態(tài)相比，均有所升高，在模擬后期，RMSD值均穩(wěn)定在0.3 nm之上。因此，我們推測，在100 ns的模擬時間內(nèi)，74截斷型銀杏抗菌蛋白Gnk-2蛋白構(gòu)象的變化主要是由二級結(jié)構(gòu)H2 helix的自身結(jié)構(gòu)變化引起的。也就是說，模擬過程中74截斷型抗菌蛋白Gnk-2之所以會發(fā)生顯著的構(gòu)象變化的主要原因，并不是因為去掉了74位置上的半胱氨酸殘基所導(dǎo)致的Cys74-Cys99之間二硫鍵的破壞，而是因為去掉了74位置上的半胱氨酸殘基，導(dǎo)致H2 helix自身結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖2(c)和圖2(d)給出了相同模擬環(huán)境下Gnk-2分子內(nèi)另外一對二硫鍵Cys62-Cys71模擬軌跡的數(shù)據(jù)情況，同理，我們可以分析得出與前一種情況相似的實驗結(jié)論。

圖2 二硫鍵斷裂的截斷型Gnk-2的結(jié)果。Fig. 2 The results for reduced Gnk2 in the absence of Cys74-Cys99 disul fide bond (R74).

以上兩種情況的模擬結(jié)果說明，在100 ns的模擬時間內(nèi)，截斷型Gnk-2二級結(jié)構(gòu)H2 helix 自身殘基的缺失，才是引發(fā)模擬過程中兩種截斷型蛋白整體構(gòu)象發(fā)生變化的主要原因，這與前人文獻(xiàn)[27-28]中僅通過野生型和截斷型蛋白D值的變化趨勢，便判斷出二硫鍵的斷裂是引發(fā)蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因，并由此推理出二硫鍵在維持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用的看法，是不一致的。

2.2 分子內(nèi)二硫鍵未斷裂的截斷型Gnk-2

為了驗證蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的主要原因是蛋白自身殘基的缺失，而不是蛋白分子內(nèi)二硫鍵的斷裂，我們做了如下分析。

圖3(a)給出了360 K的情況下，野生型和72截斷型Gnk-2整體結(jié)構(gòu)D的變化。其中72截斷型Gnk-2是去除野生型Gnk-2中72位置上的蘇氨酸殘基所得，分子內(nèi)二硫鍵未遭到破壞。圖中可以看出：(1) 在100 ns的模擬時間內(nèi)，野生型和72截斷型Gnk-2的D值與模擬起始階段相比較，均有所升高。也就是說，在水溶液的環(huán)境中，野生型和72截斷型蛋白的整體構(gòu)象均發(fā)生變化，與71截斷型和74截斷型蛋白的原因一致，都是溫度升高，Gnk-2分子結(jié)構(gòu)的熱漲落和水分子的布朗運動所致。(2) 野生型Gnk-2的D值在模擬后期穩(wěn)定在0.2 nm上下，而72截斷型Gnk-2的D值在模擬后期達(dá)到0.35 nm以上，這與74截斷型和71截斷型的結(jié)果一致（見圖1至2）。即野生型Gnk-2在模擬過程中的D值相對較低，而72截斷型Gnk-2在模擬過程中的D值相對較高，變化顯著。這說明野生型Gnk-2的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著高于72截斷型Gnk-2。也就是說由于截斷型Gnk-2 72位置上蘇氨酸殘基的缺失，引發(fā)了蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著的變化。

圖3 二硫鍵未斷裂的截斷型Gnk-2的結(jié)果Fig. 3 The results for reduced Gnk2 in the presence of the disul fide bonds (R72)

由于72位置上的蘇氨酸殘基并不參與二硫鍵的形成，故此殘基的缺失只會對蛋白構(gòu)象變化產(chǎn)生一種影響，就是使蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix自身構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，使模擬過程中的D值增大。也就是說，模擬過程中，蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因是二級結(jié)構(gòu)H2 helix 殘基的缺失。

同時，圖3(b) 給出了360 K的情況下，72截斷型抗菌蛋白Gnk-2整體結(jié)構(gòu)的D值與該蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix的D值的變化。圖中可以看出，在100 ns的模擬時間內(nèi)，72截斷型Gnk-2整體結(jié)構(gòu)的D值與該蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix的D值的變化基本一致：與模擬起始狀態(tài)相比，均有所升高。72截斷型抗菌蛋白的整體結(jié)構(gòu)的D值在模擬后期穩(wěn)定在0.3 nm上下，而該蛋白二級結(jié)構(gòu)H2 helix的D值在模擬后期穩(wěn)定在0.35 nm之上，高于整體蛋白的D值。這可以說明72截斷型Gnk-2蛋白構(gòu)象的變化主要是由二級結(jié)構(gòu)H2 helix自身結(jié)構(gòu)變化引起的，同時，又因為72位置上的蘇氨酸殘基并不參與二硫鍵的形成。

因此，我們可以得到結(jié)論：72截斷型Gnk-2二級結(jié)構(gòu)H2 helix自身殘基的缺失，才是引發(fā)模擬過程中截斷型蛋白整體構(gòu)象發(fā)生變化的主要原因，這與此殘基是否參與二硫鍵的形成，模擬過程中二硫鍵是否遭到破壞，并不相關(guān)。

2.3 分子內(nèi)二硫鍵斷裂的突變型Gnk-2

為了進(jìn)一步驗證上述模擬過程中二硫鍵的破壞并不是造成蛋白構(gòu)象變化的主要原因的觀點，我們做了以下分析。

圖4給出了360 K的情況下野生型Gnk-2和突變體Gnk-2整體結(jié)構(gòu)D的變化。其中突變體蛋白的10,62,71,74,86,99位置上的半胱氨酸殘基均被丙氨酸所替代，分子內(nèi)的三個二硫鍵：Cys10-Cys85, Cys62-Cys71和Cys74-Cys99均遭到破壞。圖中可以看出，(1) 在100 ns的模擬時間內(nèi)，野生型和突變體Gnk-2的D值較模擬起始階段均有所升高，這說明在水溶液的壞境中，野生型和突變體Gnk-2的整體結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化，與上文所述一致，這都是溫度升高，Gnk-2分子結(jié)構(gòu)的熱漲落和水分子的布朗運動所致。(2) 模擬過程中，野生型和突變體Gnk-2整體結(jié)構(gòu)的D值的變化基本一致，在模擬后期，兩種蛋白的D值基本重合，均穩(wěn)定在0.2 nm上下。這說明野生型和突變體Gnk-2的構(gòu)象變化基本一致，突變體蛋白并沒有因為分子內(nèi)三對二硫鍵的破壞而發(fā)生更加顯著的構(gòu)象變化，也就是說，在100 ns的模擬時間內(nèi)，二硫鍵的破壞并不是造成蛋白構(gòu)象變化，使蛋白構(gòu)象失穩(wěn)的主要原因。

圖4 二硫鍵斷裂的突變型Gnk-2的結(jié)果Fig. 4 The results for mutant Gnk2 in the absence of the disul fide bonds (MT3)

綜上所述，在100 ns的模擬時間內(nèi)，造成Gnk-2蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因，是蛋白自身殘基的缺失而并不是二硫鍵的斷裂。這與前人文獻(xiàn)中[27,28]僅通過100 ns的模擬時間內(nèi)野生型和截斷型蛋白RMSD值的變化趨勢，便判斷出二硫鍵的斷裂是引發(fā)蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因的看法，是不一致的。

3 結(jié) 論

本文通過大量的分子動力學(xué)模擬，研究了二硫鍵以及蛋白自身殘基在蛋白維持構(gòu)象穩(wěn)定中起到的作用，并對野生型，截斷型和突變型的銀杏抗菌蛋白Gnk-2的構(gòu)象變化進(jìn)行了分析。通過對模擬軌跡的分析可以發(fā)現(xiàn)在360 K，100 ns的模擬過程中：

截斷型Gnk-2的構(gòu)象變化比野生型Gnk-2的構(gòu)象變化顯著，并且無論分子內(nèi)二硫鍵是否斷裂，截斷型蛋白整體構(gòu)象的變化均與自身二級結(jié)構(gòu)H2 helix的變化基本一致。其中所截斷殘基位于二級結(jié)構(gòu)H2 helix上。而突變型蛋白和野生型蛋白的構(gòu)象變化基本一致，均不顯著。綜上所述，在100 ns的模擬時間內(nèi)，造成蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因是蛋白自身殘基的缺失。短時間內(nèi)二硫鍵維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面的作用并不顯著。而Castellanos等[27]和Ning LuLu等學(xué)者[28]分別針對的二硫鍵在HSA和huPrP中100 ns的作用研究。僅過野生型和截斷型蛋白RMSD值的變化趨勢，便判斷出二硫鍵的斷裂是引發(fā)蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化的主要原因的看法，是缺乏一定的研究支持的。本研究結(jié)果驗證短時間構(gòu)象變化的主因其實是蛋白質(zhì)自身殘基的缺失。

當(dāng)然，本研究通過對照研究，雖然確定100 ns內(nèi)二硫鍵對穩(wěn)定性影響并不顯著，然而真正確定二硫鍵對蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響，必須做更多更大時間尺度內(nèi)（微秒級別）的模擬。這將在后續(xù)的工作中進(jìn)行研究。

總之，上述研究結(jié)果對理解短時間內(nèi)影響Gnk-2分子穩(wěn)定性的因素著重要意義?？梢詾殂y杏抗菌蛋白的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品或者新抗菌制劑的開發(fā)、儲存以及應(yīng)用提供一定的參考和借鑒。

[1]汪貴斌, 曹福亮, 張往祥. 銀杏品種耐鹽能力的研究[J]. 林業(yè)科學(xué), 2003, 39(5): 168-172.

[2]郭藹光, 牛衛(wèi)寧. 銀杏種仁中抗菌蛋白的純化及性質(zhì)[J]. 西北植物學(xué)報, 2003, 23(9): 1545-1549.

[3]荊貝貝. 銀杏果仁中抗菌膚的分離純化、性質(zhì)鑒定銀杏種仁及其總RNA提取[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2006.

[4]黃小炯, 區(qū)子弁, 王 琴. 銀杏抗菌蛋白的提取及其抗菌性研究[J]. 工藝技術(shù), 2008, 29(10): 139-142.

[5]劉 縉, 王亞紅, 王 強, 等. 銀杏果仁抗菌蛋白的分離純化及其基因克隆和原核表達(dá)初步研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2010, 18(2): 246-253.

[6]賈韶千. 銀杏抗氧化膚的制備、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué), 2011.

[7]郁萬文, 曹福亮, 吳廣亮. 葉面配施鎂鋅鉬對銀杏苗葉生長和藥用品質(zhì)的影響[J]. 西北植物學(xué)報, 2012, 32(6): 1214-1221.

[8]曹福亮, 汪貴斌, 郁萬文. 銀杏葉用林定向培育技術(shù)體系的集成[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2014, 38(6):146-152.

[9]吳海霞. 銀杏種仁抑菌蛋白及其抑菌機制研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué), 2014.

[10]王歡利, 劉新亮, 郁萬文, 等. 銀杏葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因（GbLhcb4） 及其啟動子克隆[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2015, 35(5): 144-121.

[11]Sawano Y, Miyakawa T, Yamazaki H,et al. Purification,characterization, and molecular gene cloning of an antifungal protein from Ginkgo biloba seeds[J]. Biological Chemistry, 2007,388(3): 273-280.

[12]Wedemeyer W J, Welker E, Narayan M,et al.Current Topics Disulfide Bonds and Protein Folding[J]. Biochemistry, 2000,39(15): 4207-4216.

[13]Hayashi J, Watanabe H, Kurose R,et al.Effects of fuel droplet size on soot formation in spray flames formed in a laminar counter flow[J]. Proceedings of the Combustion Institute, 2011,158(12): 2559-2568.

[14]Steudel R. Properties of Sulfur-Sulfur Bonds[J]. Angewandte Chemie International Edition in English, 1975, 14(10): 655-664.

[15]Creighton T E. Disulphide Bonds and Protein Stability[J].BioEssays, 1988, 8: 655-664.

[16]Cooper A, Eyles S J, Radford S E,et al. Thermodynamic Consequences of the Removal of a Disulphide Bridge from Hen Lysozyme[J]. Journal of Molecular Biology, 1992, 225: 939-943.

[17]Drakopoulou E, Vizzavona J, Neyton J,et al. Consequence of the Removal of Evolutionary Conserved Disulfide Bridges on the Structure and Function of Charybdotoxin and Evidence That Particular Cysteine Spacings Govern Specific Disulfide Bond Formation[J]. Biochemistry,1998, 37(5): 1292-1301.

[18]Siddiqui K S, Poljak A, Guilhaus M,et al.Role of Disulfide Bridges in the Activity and Stability of a Cold-Active-Amylase[J]. Journal of Bacteriology, 1972, 103(1):171-174.

[19]Vaz D C, Rodrigues J R, Sebald W,et al.Enthalpic and entropic contributions mediate the role of disul fide bonds on the conformational stability of Interleukin-4[J]. Protein Science,2006, 15(1): 33-44.

[20]MAITI N R, SUREWICZ W K. The Role of Disul fide Bridge in the Folding and Stability of the Recombinant Human Prion Protein[J].Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(4): 2427-2431.

[21]Cho S S, Levy Y, Onuchic J N,et al. Overcoming residual frustration in domain-swapping: the roles of disul fide bonds in dimerization and aggregation[J]. Physical Biology, 2005, 2(2):S44-S55.

[22]Allison J R, Moll G, Gunsteren W F Van. Investigation of Stability and Disul fide Bond Shuf fling of Lipid Transfer Proteins by Molecular Dynamics Simulation[J]. Biochemistry, 2010,49(32): 6916-6927.

[23]Clarke J, Hounslow A M, Bond C J,et al.The effects of disul fide bonds on the denatured state of barnase[J]. Protein Science, 2000,9(12): 2394-2404.

[24]Godwin A, Elisa J C, Balan S,et al. Molecular dynamics simulations of proteins with chemically modified disulfide bonds[J]. Theoretical Chemistry Accounts, 2007,117(2):259-265.

[25]Qin M, Zhang J, Wang W. Effects of Disul fide Bonds on Folding Behavior and Mechanism of the b -Sheet Protein Tendamistat[J].Biophysical Journal, 2006, 90(1): 272-286.

[26]Moghaddam M E, Naderi-manesh H. Role of Disul fide Bonds in Modulating Internal Motions of Proteins to Tune Their Function :Molecular Dynamics Simulation of Scorpion Toxin Lqh III[J].Proteins Structure Function & Bioinformatics, 2006, 63(1): 188-196.

[27]Castellanos M M, Colina C M. Molecular Dynamics Simulations of Human Serum Albumin and Role of Disulfide Bonds[J].Journal of Physical Chemistry B, 2013, 117(40):11895-11905.

[28]Ning L, Guo J, Jin N,et al.The role of Cys179-Cys214 disul fide bond in the stability and folding of prion protein: insights from molecular dynamics simulations[J]. Journal of Molecular Modeling, 2014, 20(2): 1-8.

[29]Betz S F. Disul fide bonds and the stability of globular proteins[J].Protein Science, 1993, 2(2): 1551-1558.

[30]Miyakawa T, Miyazono K, Sawano Y,et al. Crystal structure of ginkbilobin-2 with homology to the extracellular domain of plant cysteine-rich receptor-like kinases[J]. Proteins: Structure,Function, and Bioinformatics, 2009, 77(1): 247-251.

[31]Daggett V, Levitt M. Protein Unfolding Pathways Explored Through Molecular Dynamics Simulations[J]. Journal of Molecular Biology, 1993, 232(2): 600-619.

[32]Day R, Bennion B J, Ham S,et al. Increasing temperature accelerates protein unfolding without changing the pathway of unfolding[J]. Journal of Molecular Biology, 2002,322(1):189-203.

[33]Hess B, Bekker H, Berendsen H J C,et al.LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations[J]. Journal of Computational Chemistry, 1997, 18(12): 1463-1472.

[34]Essmann U, Perera L, Berkowitz M L,et al.A smooth particle mesh Ewald method[J]. Journal of Chemical Physics, 1995,103(19): 8577-8593.

[35]Bussi G, Donadio D, Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling[J]. Journal of Chemical Physics, 2007, 126(1):1-7.

[36]Berendsen H J C, Postma J P M, Van Gunsteren W F,et al.Molecular dynamics with coupling to an external bath[J]. The Journal of Chemical Physics, 1984, 81(8): 3684-3690.

[37]Humphrey W, Dalke A, Schulten K. VMD: Visual molecular dynamics[J]. Journal of Molecular Graphics, 1996, 14(1): 33-38.

Roles of removal of disul fide bonds and of protein residues in the stability of Ginkbilobin-2

SHI Xiao-xuan, CHEN Hong
(Material Science and Engineering Institute, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Molecular dynamics (MD) simulations were used within a short time of 100 ns to study and compare the conformational changes of the wild type form with the reduced form of the protein, where the cysteine residues that formed the disul fide bonds were removed. However, an important issue is that upon the removal of residues, besides the effect of elimination of disul fide bonds, the removal of residues itself is also expected to affect the protein conformation. To determine which effect plays a critical role in affecting the conformation within the short simulation time, we take the ginkbilobin-2 as an example. The simulation results show that the conformational changes of the proteins in the short simulation time stem from the removal of residues rather than the elimination of the disul fide bond. This conclusion is important to understand the effects of disul fide bonds on protein stability and promote the development of ginkbilobin-2 genetic engineering.

molecular dynamics simulation; disul fide bonds; protein residue; Ginkbilobin-2; structure stability

S792.95

A

1673-923X(2016)10-0065-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.012

2016-03-29

國家科技部公益行業(yè)專項（201504507）資助

史曉璇，碩士研究生

陳 洪，教授；E-mail：chenhongcs@126.com

史曉璇，陳 洪. 去除二硫鍵和蛋白殘基對銀杏抗菌蛋白構(gòu)象的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2016, 36(10): 65-71.

[本文編校：吳 彬]