免疫注射法建立家兔ROU模型

摘要：目的 利用實(shí)驗(yàn)性家兔口腔黏膜組織勻漿加完全弗氏佐劑注射方法，免疫法建立復(fù)發(fā)性口腔潰瘍動(dòng)物模型，為研究人類ROU的發(fā)病機(jī)制及治療提供理論基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用從實(shí)驗(yàn)性家兔提取的口腔黏膜組織勻漿加完全弗氏佐劑，作為抗原免疫家兔。在家兔脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射上述制備抗原，每2w注射一次，共12w，定期觀察家兔口腔黏膜變化及潰瘍發(fā)病情況記錄潰瘍大小及愈合情況，切取口腔黏膜潰瘍區(qū)的組織病理切片進(jìn)行觀察，檢測(cè)血清中抗口腔黏膜抗體滴度驗(yàn)證模型建立是否成功。結(jié)果 與空白組相比，以口腔黏膜組織勻漿+完全弗氏佐劑作為抗原的實(shí)驗(yàn)組家兔都均出現(xiàn)ROU，潰瘍表面連續(xù)性破壞且有假膜覆蓋，上皮內(nèi)有密集的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，固有層炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，血清中均出現(xiàn)抗口腔黏膜抗體陽(yáng)性。結(jié)論 利用家兔口腔黏膜組織均漿作為抗原，可引起實(shí)驗(yàn)性家兔發(fā)生ROU，其臨床表現(xiàn)及組織學(xué)檢查均與人類ROU相似。

關(guān)鍵詞：家兔；口腔潰瘍模型；免疫

人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜，而動(dòng)物模型的建立為深入探討疾病的發(fā)病機(jī)理及療效機(jī)理提供基礎(chǔ)。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）又稱為復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）、復(fù)發(fā)性阿弗他口炎（re-current aphthous stomatitis，RAS），是一類慢性口腔黏膜炎癥性疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率高達(dá)20%左右，具有周期性、復(fù)發(fā)性及自限性等特點(diǎn)[2-3]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用免疫熒光法研究顯示ROU基底膜熒光效應(yīng)及血循環(huán)中存在抗口腔黏膜抗體，說(shuō)明免疫因素是ROU發(fā)病的可能因素之一[2]。由此致病機(jī)制，通過(guò)免疫因素成功建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ROU模型具有重要意義，為深入探討ROU的發(fā)生發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭家兔40只，雄性，體重（2±0.2）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。家兔基礎(chǔ)飼料：山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 新西蘭家兔30只，雄性，體重（2±0.2）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。單籠，顆粒飼料飼養(yǎng)，150g/只/d，自由飲水，室溫（20±2）℃，相對(duì)平均濕度45%，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1w。其中10只急性猝死取口腔黏膜組織備用，其余20只家兔按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組，分別為空白對(duì)照組（10只）、實(shí)驗(yàn)組（10只）。

1.2.2動(dòng)物模型建立

1.2.2.1抗原制備 15只家兔采用空氣栓塞法急性處死，無(wú)菌條件下，口腔黏膜下注射生理鹽水，剝?nèi)〖彝每谇火つそM織，用生理鹽水沖洗干凈，玻璃勻漿器勻漿，并加入磷酸鹽緩釋液，超聲波震蕩后將組織研磨液轉(zhuǎn)移分裝至1.5ml的離心管中，于4℃離心（14000rpm，10min），去沉淀物，將勻漿液置于-70℃低溫冰箱備用。免疫注射前，勻漿液中加入等量（等體積）費(fèi)氏佐劑，振蕩器將二者充分混勻，呈乳狀液（放置不分層或者滴一滴于水面，仍保持為滴狀不散開(kāi)）。

1.2.2.2動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)組30只家兔3%戊巴比妥于家兔耳緣靜脈麻醉，取俯臥位，固定家兔四肢和頭部于手術(shù)架，背部剃毛并常規(guī)消毒，將抗原乳狀液注射于家兔脊柱兩側(cè)皮內(nèi)，每次注射4點(diǎn)，每點(diǎn)1ml，1次/2w×6次。實(shí)驗(yàn)組家兔口腔黏膜于第三次注射結(jié)束后開(kāi)始出現(xiàn)不同程度充血。8w后陸續(xù)出現(xiàn)潰瘍，多集中于上唇、雙頰粘膜，潰瘍面紅腫，形態(tài)不規(guī)則，部分病損面表面可見(jiàn)黃白色偽膜，觸之疼痛反應(yīng)明顯。

1.2.2.3組織病理學(xué)檢查 建模12w結(jié)束后，按隨機(jī)數(shù)字法，處死空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組家兔各一只，3%戊巴比妥于家兔耳緣靜脈麻醉，取仰臥位，固定家兔四肢和頭部于手術(shù)架，切取對(duì)照組家兔口腔黏膜組織和實(shí)驗(yàn)組家兔口腔潰瘍黏膜組織，切取組織體積大小均為5mm×5mm×2mm。無(wú)菌生理鹽水沖洗后，10%甲醛固定液固定48h，常規(guī)石蠟包埋，以8μm厚度進(jìn)行黏膜組織橫斷面切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察口腔黏膜的組織變化。

1.2.2.4血清中抗口腔黏膜抗體檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)前，第三次注射抗原后10d及結(jié)束觀察前，從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組家兔耳緣靜脈各采血4ml，采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，以口腔黏膜勻漿作抗原，檢測(cè)血清中抗口腔黏膜抗體。

2 結(jié)果

2.1對(duì)照組家兔口腔黏膜未見(jiàn)明顯變化，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈活，飲食正常，毛色濃密光亮。實(shí)驗(yàn)組家兔口腔黏膜于第三次注射結(jié)束口腔黏膜出現(xiàn)不同程度充血，口唇處可見(jiàn)潮濕流涎，8w后陸續(xù)出現(xiàn)潰瘍，多集中于上唇、雙頰粘膜，潰瘍面紅腫，形態(tài)不規(guī)則，表面可見(jiàn)黃白色偽膜，觸之疼痛反應(yīng)明顯；家兔活動(dòng)量減少，反應(yīng)遲緩，飲食飲水量減少。

2.2組織病理學(xué)檢查HE染色后，對(duì)照組黏膜組織切片標(biāo)本顯示：黏膜上皮連續(xù)完整，固有層結(jié)締組織較致密，黏膜下層較厚可見(jiàn)小涎腺體。實(shí)驗(yàn)組織標(biāo)本切片顯示：潰瘍表面連續(xù)性破壞且有假膜覆蓋，上皮內(nèi)有密集的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，固有層炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分可見(jiàn)壞死區(qū)。

2.3血清中抗口腔黏膜抗體檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后分別測(cè)定各組家兔血清中抗口腔黏膜抗體效價(jià)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后、實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前均未檢測(cè)到抗口腔黏膜抗體，實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)后血清中檢測(cè)到抗口腔黏膜抗體。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭家兔作為理想的整體動(dòng)物模型。近年來(lái)報(bào)道，建立ROU動(dòng)物模型的方法有很多，包括化學(xué)燒灼法、自身組織抗原免疫注射法、組織剪切創(chuàng)傷法、氧自由基誘導(dǎo)法、細(xì)菌感染誘導(dǎo)法、放射法等。其中自身組織抗原免疫注射法所建模型的臨床及病理表現(xiàn)與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍最接近，且組織學(xué)檢查均表現(xiàn)為非特異性炎癥。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用新西蘭家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用健康同種異體家兔口腔黏膜組織勻漿加完全費(fèi)氏佐劑作抗原于家兔脊柱兩側(cè)行皮內(nèi)注射，引起實(shí)驗(yàn)家兔發(fā)生ROU，其病損與人類ROU相比，臨床及組織學(xué)檢查較為相似，因此可以作為人類ROU的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究人類ROU的病因和治療提供基本手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[4]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Scully C，Porter S.Oral mucosal disease：recurrent aphthous stomatitis[J].British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery，2008，46（3）：198-206.

[2]陳謙明，主編.口腔粘膜病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

[3]Chavan M，Jain H，Diwan N，et al.Recurrent aphthous stomatitis：a review[J].Journal of Oral PathologyMedicine，2012，41（8）：577-583.

[4]陶學(xué)金，李明，逢愛(ài)慧，等.免疫方法建立復(fù)發(fā)性口腔潰瘍動(dòng)物模型[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（1）：53-54.編輯/哈濤