套式反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)nested—RT—PCR與直接免疫熒光DFA用于檢測臨床鼻病毒human rhinovirus HRV基因的效果對(duì)比分析

摘要：目的 對(duì)比分析套式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）用于檢測臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因的效果。方法 選擇320例急性下呼吸道感染患兒作為研究對(duì)象，將其對(duì)積分為對(duì)照組和觀察組，分別使用套式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）檢測兩組患兒深部鼻咽分泌物（nasopharyngeal secretion，NPS）的臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因，比較兩種方法的檢測結(jié)果。結(jié)果 套式nested-RT-PCR診斷HRV病毒具有快速、簡單、操作方便、檢出率高且特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，值得臨床推廣使用。

關(guān)鍵詞：鼻病毒；急性下呼吸道感染；套式nested-RT-PCR；直接免疫熒光

人鼻病毒（HRV）是最常見的引起人類病毒性呼吸道感染的病原體，大約有50%以上的普通感冒是由該病毒硬氣的。同時(shí)，HRV還是加重哮喘的重要原因，大約70%左右的學(xué)齡前兒童的哮喘加重和HRV感染密切相關(guān)。套式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（nested-RT-PCR）是目前檢測HRV的一種生物學(xué)技術(shù)，其具有敏感性高、快速、方便等特點(diǎn)，本研究則主要是對(duì)套式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）用于檢測臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因的效果進(jìn)行對(duì)比分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月～9月在我院接受治療的確診為小兒急性下呼吸道感染（ALRTI）患兒320例作為研究對(duì)象，將其隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組160例，采集所有患兒的NPS標(biāo)本進(jìn)行HRV檢測，其中對(duì)照組使用DFA進(jìn)行檢測，觀察組使用套式nested-RT-PCR進(jìn)行檢測?；純耗挲g1～15歲，平均（7.2±1.8）歲，男239例，女81例，診斷為肺炎278例，毛細(xì)支氣管炎6例，急性支氣管炎10例，喘息性支氣管炎26例。兩組患兒在年齡、性別等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 采集所有患兒的深部NPS加入生理鹽水置于無菌收集管中，放置與-70℃的低溫冰箱保存。分別使用套式nested-RT-PCR與DFA檢測深部NPS標(biāo)本中的HRV基因。套式nested-RT-PCR操作步驟為：首先進(jìn)行病毒RNA的提取，然后通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行套式聚合酶鏈反應(yīng)，電泳后觀察檢測結(jié)果。DFA操作步驟：首先用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進(jìn)行稀釋，然后低滴加適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記物，在使用PBS沖洗、浸泡，然后滴加緩沖甘油，用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)記錄所得數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用（x±s）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用百分率表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患兒HRV檢出率和檢測時(shí)間比較具體見表1。

根據(jù)表1可知，使用套式式nested-RT-PCR檢測的陽性率為33.75%，使用DFA方法檢測的陽性率為7.5%，兩組陽性率比較具有顯著差異（P<0.05），提示套式nested-RT-PCR檢測方法陽性檢出率顯著DFA。

3 討論

HRV是最常見的導(dǎo)致普通感冒在內(nèi)的呼吸道感染的原因，越來越多的研究吧表明HRV是引起小兒呼吸道感染的重要病原體之一[1]。HRV的感染以小年齡的兒童為主，具有明顯的季節(jié)分布特征，在3～5月為最高峰，HRV感染的檢出率根據(jù)檢測方法的不同而不同，傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)檢測兒童肺炎的HRV，陽性率約為3%～10%，而采用套式nested-RT-PCR檢測HRV的檢出率有了提高，大約在30%左右。

本研究中使用深部NPS標(biāo)本進(jìn)行病毒的分離、抗原檢測和套式nested-RT-PCR檢測，能夠準(zhǔn)確地鑒定LRI病毒病原。套式nested-RT-PCR檢測HRV具有快速、敏感、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，監(jiān)測的可靠性高[2，3]。DFA則是將熒光標(biāo)記在相關(guān)抗體上，直接與相應(yīng)的抗原反應(yīng)。該種加測方法操作簡便、特異性高、廉價(jià)、有效，商品化的免疫熒光檢測試劑對(duì)常見的呼吸道病毒進(jìn)行檢測的診斷方法經(jīng)過了WHO的審評(píng)，結(jié)果可靠，但缺點(diǎn)是敏感性較低，每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體，而且其在檢測HRV方面不能將其優(yōu)勢顯現(xiàn)出來[4，5]。本研究結(jié)果顯示：使用套式式nested-RT-PCR檢測的陽性率為33.75%，使用DFA方法檢測的陽性率為7.5%，兩組陽性率比較具有顯著差異（P<0.05）。

綜上所述，套式nested-RT-PCR診斷HRV病毒具有快速、簡單、操作方便、檢出率高且特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，值得臨床推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

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[3]吳栩，汪夭林，陳志敏，等.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測呼吸道標(biāo)本人偏肺病毒臨床研究[J].中國實(shí)用兒科雜志，2012，（08）：332-334.

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[5]李安，崔言順，沈志強(qiáng)，等.新型反轉(zhuǎn)錄、復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-nPCR）鑒別豬瘟強(qiáng)毒和弱毒疫苗方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，（01）：78-81.

編輯/哈濤