大鼠二次腦挫傷模型的建立

摘要：目的 嘗試建立一種存在二次腦挫傷的大鼠模型。方法 成年SD大鼠，性別不限，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、一次腦挫傷組及二次腦挫傷組。利用自由落體打擊裝置，對一次腦挫傷組大鼠進(jìn)行一次打擊，二次腦挫傷組在初次打擊基礎(chǔ)上1h后不同部位進(jìn)行二次打擊；一次腦挫傷組分別于打擊后0h、1h、2h后取材，二次腦挫傷組于第二次打擊后1h取材。采用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術(shù)對腦挫傷周圍C-FOS蛋白陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行觀察。結(jié)果 大鼠腦挫傷后腦皮質(zhì)挫傷區(qū)周圍C-FOS陽性細(xì)胞顯著增高（P<0.05）；二次腦挫傷組二次腦挫傷周圍C-FOS表達(dá)與一次腦挫傷后1h、2h組未打擊部位存在差異（P<0.05）；二次腦挫傷組兩處挫傷區(qū)周圍C-FOS陽性表達(dá)存在差異（P<0.05）。結(jié)論 此模型可用于初次腦挫傷后再次腦挫傷的法醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，對進(jìn)一步研究是否存在二次外傷有一定價(jià)值。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；腦挫傷；C-FOS；動(dòng)物模型

Rat Brain Contusion Model with Twice Traumatic Brain Injuries

DONG Guo-kai1，XUE Hong-tao2，XIE Hua3，SUN Xiao-ming1，YIN Wen-jiang1，LI Zhou-ru1

（1.Department of Forensic Medicine， Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002， Jiangsu，China；2. Criminal Police Brigade of Tongshan Public Security Bureau，Xuzhou 221100， Jiangsu，China；3. Criminal Police Brigade of Xinyi Public Security Bureau， Xuzhou 221400， Jiangsu，China）

Abstract：Objective To establish a brand new rat model for researches after twice traumatic brain injuries in forensic investigation. Methods Mature SD rats were classified into 3 groups randomly， A： sham-operated group， B： brain injury once， and C： brain injury twice， without restriction of gender. The injuries were introduced using a free fall device to the left side of the brain of rats in group B and C. 1 hour later， the same injure was introduced to the other side of the brain of rats in group C. Samples were taken at 0h， 1h， 2h after injury for group B. For group C， both sides were sampled 1h after the second injury. The expression of C-FOS protein was tested as indicator for injury with laser scanning confocal microscope together with the computer colorful image analysis technique. Results The C-FOS expressed differently in the pan-injury areas between group B and C at different time point （ P<0.05）. Differences were also found between the pan-area of the first and second injury in Group C （ P<0.05）. Conclusion This model could be used in the studies for the secondary injury. It could also help investigate the exits of the secondary injury.

Key words：Forensic pathology；Brain injury；C-COS；Animal model

部分交通事故、高墜、打架斗毆等案件中，存在外傷后偽造車禍、高墜及二次撞擊等初次顱腦外傷后再次外傷的情況，能否準(zhǔn)確判斷是否存在二次外傷是法醫(yī)病理學(xué)的難題。在目前法醫(yī)實(shí)踐中尚無確切依據(jù)，主要是靠法醫(yī)自身經(jīng)驗(yàn)及案情調(diào)查?，F(xiàn)有二次腦損傷模型主要是外傷性腦損傷之后復(fù)合低血壓、低氧血癥等，用于臨床基礎(chǔ)研究[1]，尚無一種模型能夠滿足二次顱腦外傷的法醫(yī)學(xué)研究。腦挫傷是常見的機(jī)械性損傷[2]，研究發(fā)現(xiàn)，腦挫傷后腦皮質(zhì)挫傷區(qū)C-FOS陽性表達(dá)短時(shí)間內(nèi)即呈上升趨勢[3-6]。本實(shí)驗(yàn)利用自由落體打擊裝置，在腦挫傷模型基礎(chǔ)上，對大鼠初次腦挫傷后不同部位再次打擊，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測技術(shù)，了解C-FOS在大鼠初次腦挫傷與二次腦挫傷后的表達(dá)差異，探索建立二次腦挫傷模型。

1資料與方法

1.1一般資料 健康SD大鼠25只（徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量160～220g。C-FOS一抗 （sc-34273），AP標(biāo)記的二抗（Sigma Chemical公司），驢抗兔熒光二抗（A21207， Invitrogen公司），BCA試劑盒 （浙江碧云天生物試劑有限公司）。ZH-ZYQ 型自由落體腦損傷模型打擊器（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），F(xiàn)V1000 激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司），JD801 病理圖像分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型的建立 健康SD大鼠25只隨機(jī)分為假手術(shù)組（5只）、一次腦挫傷組（15只）、二次腦挫傷組（5只）。一次腦挫傷組按照顱腦損傷后處死時(shí)間不同又分為一次腦挫傷0h、1h、2h三個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只大鼠，二次腦挫傷組于第一次打擊后1h于不同部位進(jìn)行第二次打擊，第二次打擊后1h處死大鼠。

1.2.2大鼠二次腦挫傷模型的建立 利用自由落體腦損傷模型打擊器建立模型：大鼠用20%水合氯醛（350 g/kg）腹腔麻醉后俯臥位固定頭部及四肢，除去頭皮處鼠毛。用手術(shù)刀切開大鼠頭部中線皮膚，切口后端以45°角分別向兩側(cè)剝離骨膜，充分暴露雙側(cè)頂部顱骨，分別在雙側(cè)人字縫前、矢狀縫旁分別鉆直徑5mm圓形骨窗，保持硬腦膜完好，將撞桿頭端置于骨窗硬腦膜外。一次腦挫傷組利用自由落體腦損傷模型打擊器，以30g打擊棒從25cm高度落下沖擊撞針，造成大鼠左側(cè)局部腦挫裂傷；二次腦挫傷組在一次腦挫傷后1h以同樣方法形成右側(cè)局部腦挫裂傷。假手術(shù)組采用同樣麻醉及手術(shù)步驟，但不用打擊棒打擊動(dòng)物頭部，一次腦挫傷組不打擊右側(cè)骨窗，所有大鼠處死后均在大腦兩側(cè)進(jìn)行取材。

1.2.3激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)C-FOS蛋白表達(dá) 建立大鼠腦挫傷模型后取不同時(shí)間點(diǎn)，用20%水合氯醛 （350mg/kg）腹腔麻醉大鼠，于劍突下橫向沿胸壁左右向剪開暴露心臟，用平頭穿刺針從心尖插入左心室，剪開右心耳，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛后固定6h，30%的蔗糖脫水至腦組織下沉，OCT包埋。切片，厚度25μm。取冰凍切片，0.4%的Triton X100-PBS打孔15min，4℃血清封閉1h，加入C-FOS一抗4℃過夜，0.1% Triton X100-PBS洗滌5min×3次，加入熒光二抗，避光室溫孵育2h，甘油-PBS封片，激光共聚焦顯微鏡 （Olympus FV1000） 掃描圖片。紅色熒光為C-FOS，代表C-FOS的陽性細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Fos陽性以個(gè)數(shù)表示，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng) （200×）顯微鏡下分別記數(shù)，所有數(shù)值均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間、組內(nèi)比較用？字2 檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)C-FOS陽性細(xì)胞數(shù)較少，在外傷后2h腦挫傷周圍C-FOS陽性細(xì)胞內(nèi)顯著增高（P<0.05）；二次腦挫傷組二次腦挫傷區(qū)周圍C-FOS表達(dá)與一次腦挫傷組未打擊部位存在差異（P<0.05）；二次腦挫傷組兩處腦挫傷區(qū)周圍C-FOS陽性表達(dá)存在差異（P<0.05），見圖1，表1。

假手術(shù)組、一次腦挫傷0h組雙側(cè)腦皮質(zhì)及一次腦挫傷1h、2h組打擊部位對側(cè)有少量C-FOS表達(dá)；與假手術(shù)組比較，一次腦挫傷1h、2h組腦挫傷周圍及二次腦挫傷組雙側(cè)腦挫傷周圍C-FOS表達(dá)顯著增高（1P<0.05）；二次腦挫傷組二次腦挫傷周圍C-FOS表達(dá)與初次腦挫傷1h、2h組打擊部位對側(cè)存在差異（2P<0.05）；二次腦挫傷組兩處腦挫傷周圍C-FOS陽性表達(dá)存在差異（3P<0.05）。

3討論

目前有包括自由落體、液壓沖擊、旋轉(zhuǎn)加速等多種創(chuàng)傷性腦損傷模型[7-10]，用于研究腦損傷發(fā)生機(jī)制及神經(jīng)損傷后修復(fù)。在法醫(yī)病理學(xué)方面，常見采用自由落體裝置模擬顱腦損傷[11]，該方法簡單實(shí)用、可行性強(qiáng)，且可以在打擊部位形成局部腦挫傷，在此基礎(chǔ)上有較多關(guān)于顱腦損傷時(shí)間推斷的研究，主要采用觀察外傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織形態(tài)學(xué)改變及分析相關(guān)蛋白表達(dá)的方法，并且發(fā)現(xiàn)腦挫傷后一些蛋白的表達(dá)有時(shí)間規(guī)律性[12-14]。在當(dāng)前法醫(yī)實(shí)踐當(dāng)中，一些案件存在二次外傷的情況，目前關(guān)于鑒別初次外傷與二次外傷的研究較少，我們在自由落體裝置模擬顱腦損傷的基礎(chǔ)上，在大鼠顱腦兩側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)分別打擊，嘗試建立二次腦挫傷模型。研究發(fā)現(xiàn)，C-FOS是神經(jīng)細(xì)胞最常見的即刻早期基因之一，損傷、缺血等外界因素可迅速誘導(dǎo)C-FOS蛋白表達(dá)，已被廣泛作為神經(jīng)細(xì)胞功能的標(biāo)志物，用于腦損傷時(shí)間的推斷[3]，實(shí)驗(yàn)中觀察腦挫傷周圍C-FOS陽性表達(dá)量并與未受外傷處進(jìn)行比較。

本實(shí)驗(yàn)表明，C-FOS蛋白在腦挫傷周圍2h內(nèi)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與以往研究一致；二次腦挫傷組二次腦挫傷周圍C-FOS陽性表達(dá)與一次腦挫傷后1h、2h組對側(cè)未打擊區(qū)存在差異；對大鼠顱腦兩側(cè)分別打擊，發(fā)現(xiàn)間隔1h后，二次腦挫傷周圍C-FOS陽性表達(dá)與初次腦挫傷周圍存在差異?？梢哉J(rèn)為在大鼠顱腦兩側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)分別打擊可以用來復(fù)制二次腦挫傷，用于二次顱腦外傷的研究，為判斷是否存在二次腦外傷提供了新思路。

在一定時(shí)間段內(nèi)存在二次甚至多次顱腦損傷在當(dāng)前法醫(yī)實(shí)際檢案工作當(dāng)中并不少見，尋找初次外傷與二次外傷的判斷依據(jù)是急需解決的問題，理想的二次腦挫傷模型可以為其提供研究基礎(chǔ)，顱腦損傷復(fù)雜、多樣，各種動(dòng)物模型均有一定局限性，針對二次腦挫傷，本實(shí)驗(yàn)在較為成熟的腦損傷模型基礎(chǔ)上，初步探索建立了大鼠二次腦挫傷模型，通過觀察不同部位腦挫傷區(qū)C-FOS表達(dá)量驗(yàn)證二次腦挫傷，模型簡單實(shí)用，有一定可控性，但實(shí)驗(yàn)過程中存在樣本量、檢測指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)方法等方面問題，在以后的工作中，需要進(jìn)一步探索完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]王波定，王洪財(cái)，朱坤燦，等.創(chuàng)傷性腦損傷模型的延續(xù)與完善：二次腦損傷模型[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2013，4，12（4）：426-428.

[2]張益鵠.法醫(yī)腦挫傷的研究進(jìn)展[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2002，17（1）：51-53.

[3]胡玉蓮，許光亞，劉敏.大鼠腦挫傷后腦C-FOS、AQP-4 表達(dá)與損傷時(shí)間的關(guān)系[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（1）：24-28.

[4]樊永中，朱鳳清，周幽心.大鼠腦挫裂傷后Fos 蛋白表達(dá)及硫酸鎂的作用[J].蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20（7）：607-610.

[5]Yang K，Mu XS ， Xue JJ ， et al.Increased expression of c-fos mRNA and AP-1 transcription factors after co rtical impact injury in rats[J].Brain Res，1994，664∶141.

[6]Zhang Y，Widmayer M，Zhang B，et al. Suppression of post ischemic induced fos protein expression by an anti sense digonucleotide to c-fos mRNA leads to increased tissue damage[J]. Brain Res，1999，832（1-2）：112-116.

[7]王娜，李林.創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2009，15（10）：905-907.

[8]杜安妮，石京山.創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物模型的新進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（4）：526-529.

[9]Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to corticl injury：1， Methodolodg and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res ，1981，211：67-77.

[10]Marmarou A，F(xiàn)oda MA，van den Brink W，et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part：Pathophysiology and biomechanics[J]. J Neurosurg，1994，80（2）：301-313.

[11]吳旭，王保捷，張國華，等.大鼠腦損傷分級自由落體打擊模型的建立[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（1）：1-3.

[12]李周儒，騰道輝，董國凱.大鼠腦挫傷后caspase-3 和HAX-1 的表達(dá)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（1）：7-14.

[13]劉玉利，田亞汀，田曉菲.大鼠腦挫傷后NTE 與COX-2 表達(dá)隨時(shí)間的變化[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（1）：22-29.

[14]郭曉沖，李如波，梁紅霞.大鼠腦挫傷后基質(zhì)金屬蛋白酶3 的表達(dá)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（ 1）：1-5.

編輯/馮焱