轉(zhuǎn)染微小RNA—132對骨肉瘤SaOS—2細胞生長和凋亡的作用

摘要：目的 觀察轉(zhuǎn)染微小RNA-132 （miR-132）對體外人骨肉瘤細胞株SaOS-2生長和凋亡的影響，并初步探討其作用機制。方法 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測34例骨肉瘤組織及癌旁正常組織中miR-132 mRNA的表達；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）法檢測細胞增殖；細胞經(jīng)DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡；Western blot檢測體外SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表達。結(jié)果 miR-132 mRNA在骨肉瘤組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與對照組相比較，轉(zhuǎn)染組細胞中miR-132 mRNA的表達明顯升高，細胞増殖被明顯抑制，凋亡細胞顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）；Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白在轉(zhuǎn)染組細胞中的表達均下調(diào)，與對照組相比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論 轉(zhuǎn)染miR-132對體外骨肉瘤細胞有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，miR-132有望成為骨肉瘤治療的新靶點。

關(guān)鍵詞：骨肉瘤；miR-132；凋亡

Effects of MicroRNA-132 Transfection on the Proliferation and Apoptosis in Osteosarcoma SaOS-2 Cell Line in Vitro

ZHOU Qi

（The First People Hospital of Yueyang，Yueyang 414000， Hunan，China）

Abstract：Objective To observe the biological role and underlying mechanism of miR-132 in osteosarcoma proliferation and apoptosis. Methods The expression of miR-132 mRNA in the cancer tissue and their adjacent tissues in 34 osteosarcoma patients were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The biological effects of miR-132 transfection on osteosarcoma SaOS-2 cells were assessed by CCK-8 assay and DAPI staining. Western blotting was used to detect the expression of Mucin-4， HER-2 and p-FAK in SaOS-2 cells. Results The expression level of miR-132 mRNA was found to be downregulated in osteosarcoma tissues compared with the matched adjacent tissues. After transfection， the expression of miR-132 mRNA was significantly higher than control group. The proliferation of SaOS-2 cells was inhibited significantly by miR-132 transfection. Apoptosis rate induced by the miR-132 transfection was markedly higher than that of control. The proteins of Mucin-4， HER-2 and p-FAK were decreased after miR-132 transfection. Conclusion miR-132 is downregulated in osteosarcoma tissues， transfected of miR-132 can effectively inhibit proliferation and promote apoptosis of SaOS-2 cells in vitro， miR-132 may become a new target for the regulation of gene expression in osteosarcoma.

Key words：Osteosarcoma； miR-132； Apoptosis

1引言

骨肉瘤為最常見成骨性惡性腫瘤，多發(fā)于青少年，極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，當前基因治療逐漸成為惡性腫瘤治療的前沿。微小RNA（microRNA， miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在組織炎癥反應(yīng)、細胞增殖與凋亡、組織分化以及惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展等多種生理過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。其中miR-132是當前研究熱點之一，miR-132不僅在結(jié)腸癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞中表達下調(diào)，同時與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[2， 3]，表明miR-132可能作為抑制惡性腫瘤的新作用靶點。為進一步明確miR-132調(diào)控惡性腫瘤生物學(xué)行為中的作用機制，本研究運用PCR技術(shù)觀察miR-132 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中的表達差異，并通過轉(zhuǎn)染miR-132至骨肉瘤細胞，檢測其對體外骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響，探討miR-132作為治療骨肉瘤新靶點的價值。

2資料與方法

2.1 一般資料 34例骨肉瘤組織標本取自2008年06月～2013年9月在我院骨外科行手術(shù)切除的骨肉瘤及對應(yīng)的癌旁正常組織手術(shù)標本。其中男性11例，女性23例，年齡12～45歲，中位年齡23.6歲，所有病例均術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為骨肉瘤，術(shù)前均未行放化療，全部標本取材后迅速置于- 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 主要試劑 胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和含0.25%EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Mucin-4、HER-2、p-FAK、FAK和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；CyTM3標記miRNA-132 mimic購自銳博生物科技有限公司；SYBR實時熒光定量試劑盒、Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit、U6 snRNA real-time PCR Normalization Kit和脂質(zhì)體LipfectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。

2.3 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株SaOS-2購自ATCC，細胞培養(yǎng)在含l0%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

2.4 RT-qPCR檢測腫瘤組織中miRNA-132的表達 用Trizol試劑提取腫瘤組織及癌旁正常組織中的總RNA，按說明書操作?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處光密度比值（D260/D280）為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA純度。采用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR實時熒光定量試劑盒進行實時定量PCR檢測，反應(yīng)在25 μl體系中進行，反應(yīng)條件：50 ℃下30 min逆轉(zhuǎn)錄，94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作為內(nèi)參，miR-132的相對表達量采用2-△△Ct計算。

2.5 miR-132轉(zhuǎn)染及分組 將處于對數(shù)生長期的SaOS-2細胞按4×106個/孔接種到6孔板，每孔2 ml，細胞貼壁后分兩組：①對照組：在培養(yǎng)基中加入濃度為50 nmol/L的Lipofectamine 2000；②轉(zhuǎn)染組：在培養(yǎng)基中加入濃度為50 nmol/L 的CyTM3標記miRNA-132 mimic。培養(yǎng)24 h后收集細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.6 RT-qPCR檢測miR-132轉(zhuǎn)染后miR-132的表達 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA并檢測RNA的完整性和純度，按照Hairpin-itTM miRNAs qPCR Quantitation Kit說明書進行操作，以U6 snRNA作為內(nèi)參，miR-132的相對表達量采用2-△△Ct計算。

2.7 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的SaOS-2細胞，制成單細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種到96孔板，每孔200 μl，細胞貼壁后放置培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白調(diào)零組（不加細胞，加入等量的PBS）。培養(yǎng)結(jié)束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 ml后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，選擇酶標儀波長為490 nm，測量吸光度值（A490）。

細胞存活率 =（實驗組A490值-空白調(diào)零組A490值）/（對照組A490值-空白調(diào)零組A490值）×100%

2.8 熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的SaOS-2細胞調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，取1 ml細胞懸液接種于普通載玻片上，放置于6孔板上，待細胞過夜貼壁后，經(jīng)甲醛固定后再加DAPI溶液染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.9 Western blot檢測蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染miR-132的SaOS-2細胞，裂解細胞并分離細胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1：1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1：2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

2.1數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，正態(tài)分布變量兩組間比較用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 miR-132 mRNA在骨肉瘤組織和癌旁正常組織中表達 實時熒光定量PCR結(jié)果表明，在34例骨肉瘤及對應(yīng)的癌旁正常組織手術(shù)標本中，miR-132 mRNA的相對表達量分別為0.25±0.04和0.84±0.19，有顯著性差異（P < 0.05）。

3.2各組SaOS-2細胞中miR-132 mRNA的表達 SaOS-2細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染CyTM3標記的miRNA-132 mimic后，miRNA-132 mRNA的相對表達量為4.27±0.58，與對照組（0.68±0.16）相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3.3 CCK-8法檢測各組SaOS-2細胞增殖 如圖1所示，CCK-8結(jié)果表明，自48 h起，轉(zhuǎn)染組細胞存活率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在第96 h，轉(zhuǎn)染組細胞存活率最低，為45.6%。

圖1 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染miR-132對SaOS-2細胞增殖的影響，

與對照組相比較，*P < 0.05。

3.4 流式細胞術(shù)檢測SaOS-2細胞凋亡 細胞經(jīng)DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察到對照組SaOS-2細胞核完整，大小一致，而轉(zhuǎn)染組細胞核出現(xiàn)明顯固縮和凋亡小體等典型凋亡特征性改變（圖2）。

對照組 轉(zhuǎn)染組

圖2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染miR-132后對SaOS-2細胞凋亡的影響（×400）。

3.5 轉(zhuǎn)染miR-132后對SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白表達的影響 如圖3所示，Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組相比較，轉(zhuǎn)染組SaOS-2細胞中Mucin-4、HER-2和p-FAK蛋白的表達明顯下調(diào)，而FAK的表達無明顯影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

圖3 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染miR-132后對SaOS-2細胞中Mucin-4、

HER-2和p-FAK蛋白表達的影響，以β-actin為內(nèi)參。

4討論

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過特異性識別靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)位點而抑制蛋白翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[1]。近年來研究表明miRNAs與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切，其中miR-132 是目前比較公認的抑癌性miRNA，miR-132已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤中表達降低[2， 3]。miR-132主要是通過調(diào)控靶基因從而發(fā)揮抗腫瘤的作用，目前發(fā)現(xiàn)的幾十種miR-132靶基因中，大多數(shù)已經(jīng)被證實可直接調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為，例如PDCD4基因可抑制細胞增殖，ZEB2基因可抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等[3， 4]。因此miRNAs有望成為惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估中新的分子靶點，但miR-132對骨肉瘤生長和凋亡的作用及其作用機制尚未見報道。為此，本研究比較了miR-132 mRNA在34例骨肉瘤組織及癌旁正常組織標本中的表達差異，結(jié)果表明miR-132 mRNA在骨肉瘤組織中的表達明顯降低，表明miR-132與骨肉瘤的發(fā)展過程關(guān)系密切。

癌癥的發(fā)生是多基因和多因素共同參與的細胞增殖、分化以及凋亡異常的過程，而腫瘤細胞凋亡異常與惡性腫瘤的關(guān)系最為密切，在既往研究中，miR-132被證實能抑制惡性腫瘤生長，并誘導(dǎo)細胞凋亡[5， 6]，但目前尚未有miR-132對骨肉瘤細胞作用的研究報道。為進一步研究miR-132在骨肉瘤細胞生物行為中的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染miRNA-132至骨肉瘤SaOS-2細胞后，轉(zhuǎn)染組細胞中miRNA-132 mRNA的表達顯著上調(diào)，表明傳染細胞miRNA-132成功。為了分析轉(zhuǎn)染miRNA-132后對SaOS-2細胞增殖和凋亡的影響，CCK-8結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-132后對SaOS-2細胞增殖有抑制作用，同時在熒光顯微鏡下也觀察到轉(zhuǎn)染miR-132后對體外SaOS-2細胞有凋亡誘導(dǎo)作用，表明miR-132在骨肉瘤細胞生長和凋亡中的重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)Mucins家族蛋白在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及逃避機體免疫監(jiān)視等多種病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用，從而表明其在惡性腫瘤的診斷中具有一定價值[7， 8]。Mucin-4作為Mucins家族中的重要成員，Mucin-4在正常組織細胞中呈低表達或無表達，但在腫瘤組織細胞中呈高表達狀態(tài)[9]；同時Mucin-4與惡性腫瘤細胞對化療藥物耐藥性關(guān)系密切[10]；另外膜蛋白HER-2/ErbB-2作為與Mucin-4共存蛋白，HER-2蛋白在穩(wěn)定Mucin-4蛋白中起到關(guān)鍵作用，而HER-2蛋白在多種惡性腫瘤中已經(jīng)被證實與腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)[11， 12]。在本研究中，SaOS-2細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-132后，Mucin-4和HER-2蛋白的表達顯著下調(diào)，同時轉(zhuǎn)染miRNA-132后可有效抑制骨肉瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，從而首次表明Mucin-4可能作為miRNA-132的靶蛋白，并在調(diào)控骨肉瘤細胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮了一定的作用。另外，F(xiàn)AK作為HER-2的下游蛋白[13]，p-FAK與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為密切相關(guān)[14]，在本研究中，轉(zhuǎn)染miRNA-132后可顯著抑制p-FAK的表達，從而與Mucin-4和HER-2的表達結(jié)果相一致。

綜上所述，本次實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-132后不僅可顯著抑制體外骨肉瘤SaOS-2細胞生長，還能有效誘導(dǎo)體外骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制可能為miR-132通過調(diào)控Mucin-4等凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)，從而為臨床骨肉瘤基因治療提供一個新的作用靶點，但仍需進一步深入研究miR-132抗癌效應(yīng)的具體機制。

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編輯/馮焱