P16 在膽汁反流性胃炎、胃癌組織中的表達(dá)及意義

徐曉玲，徐永居，王 璐，陳 潔，王翠梅，曹 麗，凡蘭桂，沈 琴，朱海杭

江蘇省蘇北人民醫(yī)院＆揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院1.消化科;2.病理科，江蘇 揚(yáng)州225001

膽汁反流性胃炎是慢性胃炎中一種較常見的類型。膽汁反流可致胃小凹上皮增生，Dixon 等［1］通過病理研究發(fā)現(xiàn)，膽汁反流可能與胃竇黏膜腸上皮化生有關(guān)。但其對胃上皮細(xì)胞生長的影響尚不明確，其是否屬于癌前病變，與胃癌的關(guān)系需要進(jìn)一步研究探討。P16 是細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)控因子，在細(xì)胞周期調(diào)控中作用突出，它已成為腫瘤診斷的有前景的參考指標(biāo)。有研究表明，P16 基因缺失是胃癌發(fā)生的早期事件。胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能有P16 基因的變異［2］。本研究通過檢測正常胃黏膜、膽汁反流性胃炎、癌旁組織、胃癌中的P16 表達(dá)水平，探討膽汁反流性胃炎與胃癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2012 年6 月-2013 年12月江蘇省蘇北人民醫(yī)院病理科存檔的胃癌標(biāo)本51 例，男27 例，女24 例，年齡18 ～79 歲，平均年齡(54.1 ±12.1)歲。同時取癌旁組織49 例(距離腫瘤組織邊緣3 ～5 cm)，男25 例，女24 例，年齡21 ～78 歲，平均年齡(55.5 ±11.4)歲。另隨機(jī)選取同期于消化內(nèi)鏡中心診斷的膽汁反流性胃炎組織標(biāo)本52 例，男28 例，女24 例，年齡22 ～76 歲，平均年齡(51.1 ±12.5)歲。正常胃黏膜(即健康體檢者，胃鏡提示為淺表性胃炎，內(nèi)鏡下觀察無出血、糜爛等表現(xiàn))組織標(biāo)本48 例，男21例，女27 例，年齡19 ～69 歲，平均年齡(51.2 ±10.8)歲。各組患者的年齡、性別等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 免疫組織化學(xué):(1)蠟塊切片，68 ℃烤片20 min，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水;(2)熱抗原修復(fù)采用微波法。微波爐高檔加熱pH =6 的檸檬酸緩沖液1 ～2 min使溫度升至96 ℃左右，切片置于塑料架中放入緩沖液中，微波爐高檔20 min(96 ℃)，取出切片自然冷卻至室溫;(3)滴加3% 過氧化氫去離子水，37 ℃孵育10 min;(4)PBS 沖洗2 min ×3 次;(5)滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，PBS 沖洗2 min ×3 次;(6)滴加Polymer Helper，37 ℃孵育20 min，PBS 沖洗2 min ×3次;(7)滴加Poly-HRP anti-Rabbit IgG，37 ℃孵育20 min，phosphate buffered saline (PBS)沖洗2 min ×3次;(8)DAB 溶液顯色(1 ml DAB 底物緩沖液中滴加1 滴DAB 濃縮液);(9)蒸餾水充分沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、干燥、封片，PBS 代替一抗作為陰性對照。P16 兔抗人單克隆抗體、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒及DAB 試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 觀察指標(biāo) P16 蛋白的陽性判斷參照Geradts等［3］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16 在胃癌及膽汁反流性胃炎中的表達(dá) P16蛋白在胃癌中的陽性表達(dá)部位在細(xì)胞核。P16 蛋白在膽汁反流性胃炎中的陽性表達(dá)部位在細(xì)胞核(見圖1 ～2)。

圖1 P16 蛋白在胃癌中的表達(dá)(SP 400 ×);圖2 P16 蛋白在膽汁反流性胃炎中的表達(dá)(SP 400 ×)Fig 1 Expression of P16 protein in gastric carcinoma (SP 400 ×);Fig 2 Expression of P16 protein in bile reflux gastritis (SP 400 ×)

2.2 P16 在不同組織的表達(dá) P16 的表達(dá)從正常胃黏膜83.3%(40/48)、膽汁反流性胃炎48.1(25/52)、癌旁組織40.8%(20/49)、胃癌組織7.8%(4/51)中陽性表達(dá)率逐漸降低(P ＜0.05)。不同組織的P16 表達(dá)，胃癌組顯著低于癌旁組、膽汁反流性胃炎組和正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。膽汁反流性胃炎組低于正常胃黏膜組(P ＜0.05)，但癌旁組與膽汁反流性胃炎組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 腸上皮化生和不典型增生檢出率 腸上皮化生檢出率:膽汁反流性胃炎34.6%(18/52)顯著高于正常胃黏膜6. 3% (3/48)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);不典型增生檢出率:膽汁反流性胃炎42. 3%(22/52)高于正常胃黏膜10.4%(5/48)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討論

膽汁反流性胃炎是由于幽門功能不全、胃竇十二指腸協(xié)調(diào)運(yùn)動障礙、胃排空延遲或膽囊功能障礙等因素導(dǎo)致過量含膽汁的十二指腸液反流入胃，破壞胃黏膜表面的黏液屏障，損傷黏膜上皮，引起黏膜充血水腫等炎癥改變，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要依靠胃鏡診斷，在病理學(xué)上存在一定比例的腸上皮化生和不典型增生。國內(nèi)外有研究，長期膽汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關(guān)。Barrett’s 食管中膽汁反流可能有重要的致癌作用［4］。國外有學(xué)者報道膽汁反流性胃炎與胃黏膜腸上皮化生有關(guān)聯(lián)，存在胃黏膜腸上皮化生的患者胃內(nèi)總膽酸的濃度明顯高于無腸上皮化生者［5］。王學(xué)偉等［6］對大鼠膽汁反流模型研究發(fā)現(xiàn)，長期膽汁反流可導(dǎo)致大鼠胃黏膜腺上皮和鱗狀上皮顯著增生，并發(fā)生異型增生和癌變。

本組研究中膽汁反流性胃炎腸上皮化生和不典型增生檢出率分別為34.6%和42.3%，顯著高于正常胃黏膜組(6.3%和10.4%)，提示膽汁反流性胃炎可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

P16 蛋白為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白。由Kamb 和Nobori 等［7-8］于1994 年報道，P16 蛋白通過與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)競爭性結(jié)合周期蛋白依賴性激酶cyclin-dependent kinase(CDK)，從而抑制cyclinD1-CDK4或CDK6 的活性，降低抑癌基因Rb 磷酸化，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)抑癌基因作用。P16 基因表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G1期阻滯［9］。在細(xì)胞周期調(diào)控中，P16 的失活及其缺失或突變在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。有研究表明，P16 蛋白產(chǎn)物缺失或喪失活性發(fā)生在胃黏膜上皮癌變的早期階段，是重要的胃癌促發(fā)因素，該基因可能作為一個潛在的胃癌早期診斷分子標(biāo)志，是癌變早期的分子事件之一［10］。

本研究顯示，P16 的表達(dá)從正常胃黏膜、膽汁反流性胃炎、癌旁組織、胃癌組織中陽性表達(dá)率逐漸降低，且在胃癌組中的表達(dá)顯著低于其他組，提示P16 在胃癌組織中有較高頻率的缺失及表達(dá)水平下降。表明P16 基因缺失或突變而不能正常表達(dá)時引起腫瘤細(xì)胞異常增殖，P16 基因是重要的胃癌促發(fā)因素。且P16的表達(dá)在膽汁反流性胃炎組的表達(dá)顯著高于正常胃黏膜組，但癌旁組和膽汁反流性胃炎組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示膽汁反流性胃炎有癌變傾向，可能屬于癌前病變。

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