RASSF10 在腫瘤中的作用及機制研究

董騰慧，郭明洲

解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100853

RAS 蛋 白(the RAS-association domain family，RASSF)包含10 個家族成員，均含有一個RA 結(jié)構(gòu)域(RAS-association domain)，根據(jù)RA 結(jié)構(gòu)域的位置將RASSF 分為兩大類，位于羧基端的稱為經(jīng)典RASSF 家族(classical RASSF)，位于氨基端的稱為氨基端RASSF 家族(N-terminal RASSF)［1］。經(jīng)典RASSF 家族包括RASSF1A、RASSF1C、RASSF2、RASSF3、RASSF4、RASSF5A、RASSF5C 和RASSF6［2］，除RA 結(jié)構(gòu)域外，其羧基端還有一個SARAH 結(jié)構(gòu)域，可與其他蛋白相互 作 用［3］。氨 基 端 RASSF 家 族 包 含 RASSF7、RASSF8、RASSF9、RASSF10 4 種蛋白，除RA 結(jié)構(gòu)域的位置與經(jīng)典RASSF 家族不同外，還缺乏SARAH 結(jié)構(gòu)域，根據(jù)SMART 數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果提示RASSF7、RASSF8和RASSF10 有一個卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可由疏水基介導(dǎo)形成二聚體，結(jié)構(gòu)學(xué)研究證實卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與SARAH 結(jié)構(gòu)域沒有相似性［1，4］。經(jīng)典RASSF 家族與氨基端RASSF 家族在結(jié)構(gòu)上的差異提示是兩個完全不同的亞家族［1］。盡管在NRASSF 家族中RASSF7 ～10 的結(jié)構(gòu)類似但其表觀遺傳調(diào)控及生物學(xué)功能卻各有不同(見表1)。

RASSF7 及RASSF8 雖然在啟動子區(qū)分別含有一個范圍約1 015 bp 和1 201 bp 的CpG 島，但很少在腫瘤中發(fā)生甲基化［1，7，10］。RASSF9 的啟動子區(qū)無CpG島，RASSF10 啟動子區(qū)有一個2 254 bp 的富含CpG 的區(qū)域，在多種腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化且其表達受到啟動子區(qū)甲基化調(diào)控［1］。RASSF7 結(jié)合在中心體上通過影響微管的功能，促進有絲分裂進而促進腫瘤的生長［7］。RASSF8 作為抑癌基因，通過抑制Wnt 和NFκB 信號通路抑制腫瘤細胞生長和遷移［9］。RASSF9誘導(dǎo)上皮細胞的分化并抑制其生長［11，13］。本文討論RASSF10 基因在腫瘤中的表達、調(diào)控及腫瘤發(fā)生中的作用及機制。

表1 N-RASSF 成員的基本特征Tab 1 The characteristic of N-RASSF members

1 RASSF10 的分離和鑒定

RASSF10 位于人染色體11p15.2 上，是通過結(jié)構(gòu)預(yù)測獲得的與RASSF9 同源的基因，與其他氨基端RASSF 家族成員一樣，其氨基端在人、非洲爪蟾和果蠅中具有一個保守的結(jié)構(gòu)域，能夠抑制細胞有絲分裂［4］。RASSF10 在人甲狀腺、胰腺、胎盤、心臟、肺臟、腎臟、腦及骨骼肌等組織中均有表達［17］。RASSF10 基因含有一個外顯子，一個能編碼507 個氨基酸的開放閱讀框［10］，RASSF10 的啟動子區(qū)有一個范圍約2 254 bp的富含CpG 二核苷酸的區(qū)域［1］。

2 RASSF10 與人類腫瘤

2.1 RASSF10 在不同腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RASSF10 基因在多種腫瘤組織中存在啟動子區(qū)甲基化(見表2)，且其表達受啟動子區(qū)甲基化調(diào)控。

在兒童白血病細胞及正常人骨髓細胞中利用結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析(COBRA)法及硫化測序方法(Bisulfite sequencing，BSSQ)檢測RASSF10 啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF10 在兒童T 細胞白血病中甲基化率為88.5%(23/26)，在兒童B 細胞白血病中甲基化率為15.7%(8/51)，而在正常骨髓細胞中無甲基化，此外RASSF10 在7 個白血病細胞株(THP-1、U937、JKT、DND-41、SUP-T1、NALM1 及NALM6)中均呈甲基化狀態(tài)，其中白血病細胞系THP-1 及SUP-T1細胞在接受去甲基化藥物(5-Aza)及去乙酰化藥物(TSA)共同處理后RASSF10 的表達明顯上調(diào)［10］。

表2 RASSF10 在不同腫瘤中的甲基化情況Tab 2 The RASSF10 methylation status in different cancers

利用甲基化特異性 PCR (MSP)方法檢測RASSF10 在結(jié)腸癌組織中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF10 在結(jié)腸癌中的甲基化率為60.7%(54/89)，提示RASSF10 在結(jié)腸癌組織中頻繁發(fā)生甲基化［18］;另發(fā)現(xiàn)，在RASSF10 完全甲基化的結(jié)腸癌細胞系LOVO、RKO 及HCT116 中RASSF10 的表達缺失，加入5-Aza 處理后恢復(fù)表達，在RASSF10 部分甲基化的結(jié)腸癌細胞系LS180、DLD1、HT29、SW480 及SW620 中RASF10 有微弱表達，經(jīng)5-Aza 處理后表達上調(diào)，提示RASSF10 在結(jié)腸癌細胞中的表達受啟動子區(qū)高甲基化調(diào)控［18］。

RASSF10 在原發(fā)性甲狀腺癌中甲基化率為65.6%(21/32)，在濾泡狀腺瘤中甲基化率為10.0%(1/10)，在甲狀腺腫大患者中甲基化率為33.3%(4/12)，而在13 例正常甲狀腺組織中均未發(fā)現(xiàn)甲基化，RASSF10 在原發(fā)性甲狀腺癌中的甲基化率明顯高于其在濾泡狀腺瘤及正常甲狀腺中的甲基化率(P 均＜0.05)［17］。RASSF10 甲基化存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及上皮細胞起源的原發(fā)性甲狀腺癌，且甲基化率有所不同。

RASSF10 甲基化可用于原發(fā)性黑色素瘤的診斷及鑒別診斷中，如RASSF10 在原發(fā)性黑色素瘤及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的甲基化率分別為68%和91%，在增生性色素痣中的甲基化率為11%，而在無增生性色素痣中無啟動子區(qū)甲基化，提示RASSF10 的甲基化狀態(tài)可以作為區(qū)分黑色素瘤與色素痣的一個新的腫瘤標志物［20］。

RASSF10 在原發(fā)性胃癌中的甲基化率明顯高于癌旁組織(61.6% vs 38.4%，P ＜0.01)，且在胃癌中RASSF10 的甲基化狀態(tài)與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Borrmann 分型相關(guān)，RASSF10 的甲基化率隨著浸潤深度的增加而增加，T3 及T4 組RASSF10 甲基化率明顯高于T1 和T2 組(67.1% vs 37.5%，P ＜0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RASSF10 甲基化率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.8% vs 40.9%，P ＜0.05)，Borrmann Ⅳ組RASSF10 甲基化率明顯高于早期胃癌組(85. 7% vs 57.0%，P ＜0.05)［22］。另有報道顯示RASSF10 在胃癌中的甲基化率與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，對300 個胃癌患者進行多因素生存分析顯示RASSF10 甲基化是胃癌患者總生存期的一個獨立預(yù)測因素(危險比為1.687，P ＜0.001)［26］。

2.2 RASSF10 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用 在肺癌細胞系A(chǔ)549 中利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性RASSF10 蛋白可在有絲分裂間期定位于胞質(zhì)，當有絲分裂期開始時RASSF10 蛋白入核，與α-微管蛋白共定位于正在生成的紡錘體兩極及微管上，這種共定位從分裂前期一直持續(xù)到分裂末期。提示RASSF10 在細胞有絲分裂過程中可能具有一定的調(diào)控作用［19］。這一功能在原發(fā)性食管鱗癌細胞系及結(jié)腸癌細胞系中得到驗證，在食管鱗癌細胞系KYSE150 中恢復(fù)RASSF10表達，G2/M 期細胞明顯增加，RASSF10 使原發(fā)性食管鱗癌細胞系阻滯在G2/M 期［25］;在結(jié)腸癌細胞系RKO及HCT116 細胞中恢復(fù)RASSF10 表達，G2/M 期細胞也明顯增加，證明RASSF10 可使細胞周期阻滯在G2/M期［18］。

此外，在多種腫瘤中證實RASSF10 可促進細胞凋亡，如在結(jié)腸癌細胞系RKO 及HCT116 中恢復(fù)RASSF10 表達可促進細胞凋亡［18］;在食管癌細胞系KYSE150 中恢復(fù)表達RASSF10，明顯促進細胞的凋亡［25］;在前列腺癌細胞LNCaP 細胞中恢復(fù)RASSF10表達，細胞凋亡比例增加2 倍［27］;在肺癌細胞系SPCA-1 細胞中siRNA 敲降RASSF10 可抑制細胞凋亡［28］。在胃癌細胞系JRST 及BGC823 細胞系中過表達RASSF10 可誘導(dǎo)細胞凋亡［16］。

RASSF10 在調(diào)節(jié)細胞周期及細胞凋亡中的作用提示RASSF10 可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。目前發(fā)現(xiàn)RASSF10 可抑制膠質(zhì)細胞瘤、原發(fā)性食管鱗癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細胞系的生長。在U87 膠質(zhì)細胞瘤細胞系中RASSF10 表達沉默可促進細胞增殖，反之，在H4 及U343 膠質(zhì)細胞瘤細胞系中利用克隆形成實驗及軟瓊脂集落形成實驗發(fā)現(xiàn)恢復(fù)RASSF10 表達可抑制細胞增殖及細胞的錨定非依賴性生長［19］。RASSF10 抑制胃癌細胞的克隆形成及胃癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用，表明RASSF10 抑制胃癌的生成［16］。

RASSF10 對化療藥物治療敏感性也有一定的影響，多西他賽化療藥是一種有絲分裂抑制劑，在有絲分裂期特異性靶向作用于微管［29］，而RASSF10 在有絲分裂期可共定位于紡錘體兩極及微管中，且使細胞阻滯在G2/M 期，藥物敏感性實驗證明RASSF10 可提高結(jié)腸癌細胞系RKO 及HCT116 細胞對多西他賽的敏感性，提示RASSF10 甲基化可成為結(jié)腸癌細胞對多西他賽耐藥的標志物［18］。

2.3 RASSF10 在腫瘤中的作用機制 腫瘤相關(guān)基因可通過參與多種信號通路對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮作用，RASSF10 通過參與Hedgehog、Wnt/β-catenin、P53等信號通路而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在黑腹果蠅細胞中采用全基因組RNA 干擾篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)RASSF10 表達可正調(diào)控Hedgehog 信號通路［30］。在胃癌細胞中RASSF10 可促進β-catenin 核定位，下調(diào)c-Myc、cyclin D1、cyclin E1、TCF-1、TCF-4 及CD44 的表達，抑制Wnt/β-catenin 信號通路［16］。

利用結(jié)腸癌細胞系RKO 穩(wěn)定表達RASSF10 前后的mRNA 進行基因表達譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)在RASSF10穩(wěn)定表達的細胞系中MDM2 表達下調(diào)，而MDM2 是P53 信號通路中的關(guān)鍵成分，可催化P53 泛素化使其降解，提示RASSF10 可通過下調(diào)MDM2 激活P53 信號通路。進一步通過紫外照射誘導(dǎo)DNA 損傷模型，檢測各細胞株中P53、bax、活化型Caspase-3、MDM2 及bcl-2的表達，發(fā)現(xiàn)只有穩(wěn)定表達RASSF10 的細胞株P(guān)53、bax、活化型Caspase-3 的表達上調(diào)，MDM2 及bcl-2 的表達下調(diào)，表明RASSF10 在結(jié)腸癌中通過穩(wěn)定P53 而活化P53 通路，抑制腫瘤的生長［18］。

綜上所述，RASSF10 在多種腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化，且其表達受到啟動子區(qū)甲基化調(diào)控，RASSF10 甲基化可能成為腫瘤診斷、預(yù)后及化療敏感性的標志物。RASSF10 通過Wnt、P53、Hedgehog 等信號通路影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

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