一株枯草芽孢桿菌的飼料學(xué)特性研究

巨向紅，葉小妹，張金燕，徐中文，孫建華，雍艷紅（.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 54088；.廣東綠百多生物科技有限公司）

營養(yǎng)與飼料

一株枯草芽孢桿菌的飼料學(xué)特性研究

巨向紅1，葉小妹1，張金燕2，徐中文2，孫建華2，雍艷紅1
（1.廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088；2.廣東綠百多生物科技有限公司）

枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提高飼料轉(zhuǎn)化率和提高動(dòng)物免疫力等功能，是微生物飼料添加劑的常用菌種。但由于對選育、傳代和保藏等技術(shù)的不重視，導(dǎo)致其性能嚴(yán)重退化，選擇抗逆性強(qiáng)和發(fā)酵效果佳的菌株用于動(dòng)物飼料添加具有重要意義。該研究觀察了一株枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征，測定了其生長曲線、抗逆性及所發(fā)酵飼料的pH值和幾種消化酶的活力變化，以為其推廣應(yīng)用提供依據(jù)。結(jié)果表明：該株枯草芽孢桿菌具有本種所特有的形態(tài)特征；在37℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，無生長延滯期，生長對數(shù)期為0～6 h，生長穩(wěn)定期為6～10 h，生長衰亡期為10 h以后；分別在37℃、70℃、80℃、90℃和100℃的水浴中處理10min后，其存活率差異不顯著（P＞0.05）；在1%～5%的膽鹽中生長存活率均大于100%；在pH值為2的酸性環(huán)境中培養(yǎng)60min，存活率高達(dá)58.8%（P≤0.05）；發(fā)酵飼料的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長而明顯降低，而蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活力顯著升高（P≤0.05）。表明該株枯草芽孢桿菌的飼料學(xué)特性優(yōu)良，是理想的有益微生物飼料添加劑。

枯草芽孢桿菌；生長曲線；抗逆性；酶活力

畜牧養(yǎng)殖過程對抗生素的不規(guī)范使用，導(dǎo)致了病原微生物耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留和食品安全等諸多問題，并最終威脅到人類健康［1］。開發(fā)綠色新型飼用添加劑來替代或減少抗生素的使用將有助于我國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。微生態(tài)制劑是較理想的飼用抗生素替代品。其能生成乳酸、短鏈脂肪酸和抑菌活性物質(zhì)等有益因子，這不僅有利于胃腸道酸性環(huán)境的形成［2］，還能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡，促進(jìn)消化代謝和提高飼料轉(zhuǎn)化率［3］。對豬的飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明，益生菌能明顯提高豬的生長速度，改善飼料的利用率，提高仔豬存活率以及降低腹瀉的發(fā)病率［4］。

枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）是我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的可直接飼喂動(dòng)物的益生菌菌種之一［5］。近年，人們圍繞枯草芽孢桿菌菌株的篩選、發(fā)酵技術(shù)和添加策略的優(yōu)化等開展了大量的工作。但由于飼料加工過程中的高溫處理（可達(dá)90℃以上）和制粒等環(huán)節(jié)對有益微生物有明顯的殺滅作用，動(dòng)物采食后，益生菌也會被腸道環(huán)境中的胃酸、胃液和膽鹽等抑制甚至殺滅。故選擇抗逆性強(qiáng)、發(fā)酵效果好的有益微生物菌株具有重要意義。鑒于此，本研究對一株枯草芽孢桿菌的飼料學(xué)特性進(jìn)行了檢測，從而為該菌株的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株 枯草芽孢桿菌LBD-1菌株由廣東綠百多生物科技有限公司惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；Folin Ciocalteu試劑盒為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色盒購自廣東微生物科技有限公司；人工胃液、膽鹽均參照文獻(xiàn)制備，所用試劑為國產(chǎn)分析純。發(fā)酵所用飼料為正大102小雞料。

1.1.3 主要儀器 BC/BD-27生化恒溫培養(yǎng)箱購于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SPX-250B-Z超凈工作臺購于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SW-CJ-2F震蕩培養(yǎng)箱購于中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，HHS-11-4可見光分光光度計(jì)購于上海精科科技有限公司，密封型手提式粉碎機(jī)購于廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 方法

本研究過程主要參照楊鋒等［5］、董尚智等［6］、Alonso 等［7］的研究報(bào)告及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GB 8275—2009［8］、SB/T 10317—1999［9］和NY/T912—2004［10］的方法進(jìn)行。

1.2.1 枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)觀察和菌體鏡檢 將枯草芽孢桿菌LBD-1菌株進(jìn)行平板劃線后放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h，然后挑取典型菌落菌體進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢。

1.2.2 種子液制備 無菌條件下，從菌種保存斜面中挑取1環(huán)菌苔，接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即得到細(xì)菌種子培養(yǎng)液。

1.2.3 生長曲線的測定 取250mL三角瓶，裝入100mL無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按5%的接種量加入枯草芽孢桿菌種子液，混勻，于37℃和180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接入菌種后的0 h、1.5 h、3 h、4h、6h、8h、10h、12 h、14 h、16 h以及20 h無菌條件下取出適量培養(yǎng)液，分光光度計(jì)420 nm波長處測定OD值，記錄結(jié)果并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD420為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 耐酸性試驗(yàn) 以pH值為7.4的PBS緩沖液為基礎(chǔ)的營養(yǎng)肉湯，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的培養(yǎng)基。取枯草芽孢桿菌菌液1mL加入9mL上述梯度pH值的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，對照組則加入9mL的滅菌生理鹽水。置于37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，分光光度計(jì)420 nm波長處測定OD值，將不同pH值的OD值與相應(yīng)空白對照OD值之比記為該菌株的存活率。每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 耐高溫試驗(yàn) 在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中按5%的接種量加入枯草芽孢桿菌種子液，分別置入37℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴鍋中作用10min，冷卻后于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9、15和20 h，測定其OD420值，觀察和記錄生長情況。每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 耐膽鹽試驗(yàn) 在膽鹽濃度分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按5%接種量加入枯草芽孢桿菌，于37℃震蕩培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18 h，在420 nm波長下測定吸光度，不同膽鹽濃度的OD420值與相應(yīng)空白對照OD420值之比為該菌株的存活率。每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 發(fā)酵試驗(yàn)

1.2.7.1 菌液的制備 將10mL含有0.1%吐溫80的無菌水分別倒入枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基上，用接種環(huán)將斜面上的菌種和孢子刮下，置入盛有90mL無菌水的三角瓶中，用磁力攪拌器將其攪拌均勻，適當(dāng)稀釋，使密度達(dá)到1×107cfu/mL。

1.2.7.2 菌液的接種 飼料經(jīng)粉碎后，過60目篩，稱取60 g飼料裝入100mL三角瓶中，高壓滅菌25min。冷卻后將飼料粉打散，接入1×107cfu的發(fā)酵種子液，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7.3 發(fā)酵飼料的酸度及酶活性測定 發(fā)酵飼料的酸度、淀粉酶活性、蛋白酶活性和纖維素酶活性測定主要參照鐘青萍等［11］、吳勝蓮等［12］和國家輕工行業(yè)［13］、農(nóng)業(yè)部［10］酶活力測定相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 檢測不同處理組和對應(yīng)對照組在OD420波長時(shí)的吸光度，用兩者的比值代表芽孢桿菌存活率。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間的差異顯著性比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)觀察

該株枯草芽孢桿菌呈革蘭氏陽性，在接種后12 h內(nèi)，桿端鈍圓，單生或呈短鏈狀（圖1-A）。在接種后48 h，出現(xiàn)芽孢，且芽孢一般生在菌體中間或兩端，呈橢圓形或長筒形（圖1-B）。呈現(xiàn)典型的枯草芽孢桿菌形態(tài)特征。

圖1 菌株的形態(tài)觀察

2.2 菌株的生長曲線和抗逆性能觀察

對生長曲線觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株無明顯的生長延滯期，生長對數(shù)期為0～6 h，生長穩(wěn)定期為6～10 h，生長衰亡期為第10小時(shí)以后（圖2-A）。以1.5 h的OD420為標(biāo)準(zhǔn)，不同時(shí)間點(diǎn)的OD420值與其均差異極顯著（P＜0.01）。

菌株分別經(jīng)37℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴處理10min后，在培養(yǎng)的9、15和20 h測定菌液OD420，發(fā)現(xiàn)隨著處理溫度的升高，同一時(shí)間點(diǎn)的吸光度下降（圖2-B）。但在培養(yǎng)9 h后，吸光度與37℃處理組相比差異不顯著（P＞0.05）。而在培養(yǎng)15 h和20 h后，不同處理組與37℃處理組間差異極顯著（P＜0.01）。存活率則隨處理溫度的升高而逐漸降低，分別為90.83%、86.81%和87.26%。

該菌株在pH值為2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)存活率最低，僅為59%，說明酸性環(huán)境對其生長有一定的影響。隨著培養(yǎng)液pH值的逐漸升高，存活率明顯增加。在培養(yǎng)液pH值為7.5時(shí)，菌株的存活率最高，達(dá)150%（圖2-C）。說明該菌株最適宜在中性環(huán)境中生長。

該菌株在膽鹽濃度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 和0.5%的液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，存活率隨膽鹽濃度升高而逐漸降低。最高為131.22%，最低為115.45%，但均高于100%，說明該菌株具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力（圖2-D）。

圖2 菌株生長特性觀察

2.3 菌株發(fā)酵飼料的效果觀察

發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)該菌株發(fā)酵的飼料pH值隨發(fā)酵時(shí)間的推移而下降，發(fā)酵第7天為5.1，發(fā)酵第15天為4.7，均極顯著低于發(fā)酵第0天的5.6（P＜0.01）（圖3-A）。對該株枯草芽孢桿菌發(fā)酵飼料淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)（圖3-B），淀粉酶活性在發(fā)酵的第7天和第15天分別為802U/mL和919U/mL，均極顯著高于對照組的729U/mL（P＜0.01）。蛋白酶活性在發(fā)酵第7天為93 U/mL，第15天為255 U/mL，均極顯著高于對照組的53U/mL（P＜0.01）。纖維酶活性在發(fā)酵第7天為2.3 U/mL，第15天為2.5 U/mL，也均高于對照組的1.35 U/mL（P＜0.01）?？梢娫摼昴茱@著降低發(fā)酵飼料的pH值，增高淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的活性。

圖3 經(jīng)枯草芽孢桿菌LBD-1菌株發(fā)酵的飼料特性

3 分析與討論

枯草芽孢桿菌在生長過程中可產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。另一方面，其能迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道pH值，間接抑制其他致病菌的生長?？莶菅挎邨U菌還可刺激動(dòng)物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力［5］。鑒于其良好的益生效果和優(yōu)良的抗逆性能，目前在人類健康和動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用。

枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，單生或呈短鏈狀，桿端鈍圓。在惡劣環(huán)境中或者細(xì)菌衰敗期，出現(xiàn)芽孢。芽孢位于菌體中間或者兩端，呈橢圓形，是菌體抗逆性最強(qiáng)的休眠體狀態(tài)［14］。本研究所觀察的LBD-3菌株符合枯草芽胞桿菌的典型特征。據(jù)報(bào)道，枯草芽胞桿菌采用活化斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基在最佳生長條件下培養(yǎng)時(shí)，沒有延緩期，0～8 h生長速率最快，8～20 h生長速度減慢，20～32 h生長速率進(jìn)一步降低，但生長量仍在增加［5］。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該株枯草芽孢桿菌無生長延滯期，生長對數(shù)期為0～6 h，生長穩(wěn)定期為6～10 h，生長衰亡期為第10小時(shí)以后。可見該菌株生長期相對較短，說明不同菌株的生長特性可能會有差異。

成年動(dòng)物正常胃液酸度為pH值2.0～3.5，適合于消化飼料蛋白質(zhì)和抑制多種病原微生物，而仔畜分泌胃酸能力差，其胃液酸度為pH值4左右［15］，這是外源益生菌進(jìn)入動(dòng)物腸道并定居的主要障礙。此外，pH值依賴性的酸水解作用是胃內(nèi)細(xì)菌結(jié)構(gòu)被破壞的主要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)該枯草芽孢桿菌即使在pH值為2.0～3.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，存活率也高于53%，說明其有較強(qiáng)的耐酸能力。由于飼料的制粒溫度最高可達(dá)70～90℃，并持續(xù)25～30 s，故選擇耐高溫的益生菌菌株非常重要。據(jù)楊鋒等［5］報(bào)道，枯草芽孢桿菌在90℃水浴處理10min后存活率接近80%，這與本研究結(jié)果一致?？莶菅挎邨U菌LBD-1株在100℃高溫處理10min后，其存活率仍達(dá)86%。另外，對膽鹽耐受也是益生菌選育的一個(gè)重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，枯草芽孢桿菌在0.03%至0.30%的豬膽鹽培養(yǎng)基中存活率超過90%，但其生長依然受膽鹽濃度抑制［5］。在本研究中，枯草芽孢桿菌LBD-1株在含0.1%～0.5%的膽鹽培養(yǎng)基中的存活率高于100%，說明該枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。

配合飼料中含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、半纖維素和果膠等多種營養(yǎng)成分，它們由生 物多聚物組成，必須依靠水解酶類將其降解后才能被動(dòng)物腸道吸收?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵過程中可分泌多種消化酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。在本研究中，該株枯草芽孢桿菌能明顯提高發(fā)酵飼料中淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶活力。另一方面，益生菌還可顯著降低飼料的pH值。胃內(nèi)pH值降低，可增強(qiáng)胃蛋白酶的活性，間接性激發(fā)胰腺的分泌，加強(qiáng)胃腸道活動(dòng)及免疫力［16］。在本研究中，隨發(fā)酵時(shí)間的延長，飼料的pH值顯著降低，這與鄭德富等［17］的研究結(jié)果一致。但究竟發(fā)酵多長時(shí)間時(shí)酶活性及飼料營養(yǎng)價(jià)值最高還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌LBD-1株是理想的飼料添加劑用有益微生物，可用于動(dòng)物飼料添加。

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Study on the Feed Perform ance ofa Strain of BacillusSubtilis

Ju Xianghong，Ye Xiaomei，Yong Yanhong，etal
（DepartmentofVeterinaryMedicine，GuangdongOcean University，Zhanjiang524088，China）

Bacillus Subtilis isan idealprobiotic formaintaining andmodulation the flora balance ofanimal intestinalgut，aswell improving the feed conversion rateand theproduction performanceofanimal.But theperformanceof BacillusSubtilis degenerated due to thedeficiency ofbreed and unsuitable transferofculture.Choosinga strain of BacillusSubtilis thathavea strong resistance and good effecton feed fermentation asanimal feed additivesare very important.In thisstudy，themorphologicalcharacteristic ofa strain of Bacillus Subtilis whichwere donated by abiotechnological companywereobserved，aswellas thegrowth curves，the resistances tohigh temperatureand acid bileweredetected by traditionalprotocol.Furthermore，the pH valueand theactivityofdigestive enzyme of the feed fermented by Bacillus Subtilis were investigated in different time point after treatment.The results showed that thisstrain of BacillusSubtilis had noobviously lag phase，and its logarithmic growth phase，stationary phaseand decline phasewas2～6 h，6～10 h and above10 h after culturebegan respectively.No obvious changes in the survive ratewere found when pretreated by 37℃，70℃,80℃，90℃and 100℃environment for 10min aswellexposed to differential concentration of Bilesalts.Thesurvive rateof BacillusSubtilis attained to58.8%when treated by apH of2 culturebuffer for60min.ThepH value of feed fermented by the Bacillus Subtilis progressively decreased over time，in parallelwith activity of protease，amylase and cellulose increased significantly.It was concluded that this strain of Bacillus subtilis was a valuable probiotic to use in feed addition.

Bacillus subtilis；growth curve；resistance；enzyme activity

S816

A

2095-3887（2015）04-0032-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.010

2015-05-26

湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C0201）

巨向紅（1977-），男，副教授，博士。

雍艷紅（1977-），女，講師，博士，主要從事應(yīng)激性致病機(jī)理研究。