慢性氟中毒大鼠血細(xì)胞MGMT與hMLH1基因mRNA的表達(dá)

·特約專論·

慢性氟中毒大鼠血細(xì)胞MGMT與hMLH1基因mRNA的表達(dá)*

**通信作者 E-mail:xiaolan76@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2319.058.html

王煜蘅1， 蘇艷麗2， 吳昌學(xué)1， 李毅1， 官志忠1,3， 齊曉嵐1**

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴陽(yáng)護(hù)理職業(yè)學(xué)院 檢驗(yàn)系， 貴州 貴陽(yáng) 550081； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究慢性氟中毒大鼠血細(xì)胞中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MGMT)及錯(cuò)配修復(fù)基因(hMLH1)mRNA表達(dá)水平。方法： 采用飲水加氟法復(fù)制20只慢性氟中毒大鼠模型為染氟毒組，另取20只大鼠飲用含氟量<0.5 mg/L自來(lái)水為對(duì)照組，兩組大鼠飼養(yǎng)6月時(shí)，觀察大鼠氟斑牙的形成，鑒定染氟是否成功，同時(shí)采取股動(dòng)脈放血處死大鼠，提取大鼠血細(xì)胞總RNA ，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測(cè)染氟毒組及對(duì)照組大鼠 MGMT、hMLH1基因 mRNA 水平。結(jié)果： 染氟組20只大鼠全出現(xiàn)氟斑牙，表明染氟成功；氟中毒大鼠血液 MGMT、hMLH1 基因mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： MGMT和 hMLH1 mRNA水平降低可能是氟中毒引起DNA損傷的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因； 錯(cuò)配修復(fù)基因； 氟化物中毒，慢性； 大鼠,Sprague-Dawley； 模型，動(dòng)物

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAI05B03); 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160335); 貴州省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目 [黔科合計(jì)Z 字(2012)4010]; 貴州省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目[黔科合外G字(2011)7014]; 貴州省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目 [黔科合LG字(2012)009]

[中圖分類號(hào)]R599.5； R34-33

The Changes of Expression ofMGMTandhMLH1 mRNA

Levels in the Blood Cells of Chronic Fluorosis Rats

WANG Yuheng1, SU Yanli2， WU Changxue1, LI Yi1, GUAN Zhizhong1, QI Xiaolan1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofLaboratoryScience,GuiyangNursingVocationalCollege,Guiyang550081,Guizhou,China; 3.Department

ofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the effects of chronic fluorosis on the DNA repair gene O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase (MGMT) and human mismatch repair gene(hMLH1) mRNA levels in blood cells. Methods: Establish the model of chronic fluorosis rats by adding sodium fluoride to the drinking water of 20 fluorosis rats, and another 20 rats take the water with fluoride content less than 0.5 mg/L as control group. After raising them for 6 months then executing them by bleeding femoral artery, collect their arterial blood and extract the RNA, detect mRNA expression level of MGMT, MLH1 gene from each group by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: All 20 rats in experiment group showed signs of dental fluorosis, indicating successful fluoride results. The levels of MGMT and MLH1 mRNA were decreased, the transcription difference between the experimental group and control group had statistic value (P<0.05). Conclusion: MGMT mRNA and hMLH1 mRNA expression in the experimental group decrease significantly than the control group, and the reduction might be the reason in the mechanics of DNA injury.

[Key words] O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase; mismatch repair gene; fluorosis,chronic；rats, Sprague-Dawley; models, animal

氟作為一種固有化學(xué)物質(zhì)存在于自然環(huán)境，是機(jī)體必需的微量元素，但長(zhǎng)期或過(guò)量的攝入又會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷，尤其是造成氟斑牙和氟骨癥等骨相損害。有研究表明，氟對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝臟、甲狀腺以及心血管系統(tǒng)都有不同程度的損傷[1]。大量有關(guān)氟對(duì)DNA損傷的研究，揭示了氟在一定劑量時(shí)，可誘導(dǎo)口腔黏膜、肝、神經(jīng)、生殖、成骨細(xì)胞等的DNA損傷[2-3]，氟的DNA損傷與氟的骨相以及非骨相損傷的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)，并認(rèn)為氟化物可以抑制DNA的合成、DNA單鏈斷裂及 DNA氧化損傷[4]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase,MGMT) 基因以及錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair gene,MLHl) 基因是DNA修復(fù)系統(tǒng)中重要的基因，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real Time-PCR)方法對(duì)慢性氟中毒大鼠的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，觀察此類基因與氟中毒的關(guān)系。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

Trizol (Invitrogen)，異丙醇，氯仿，SYBR Green(bio-rad)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)，DU640 核酸蛋白分析儀，ABI Step one 型Realtime PCR儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠(貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量100～120 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和染氟毒組， 20只/組，組內(nèi)大鼠雌雄各半，用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組飲用自來(lái)水，含氟量低于0.5 mg/L；染氟組飲用加入氟化鈉(sodium fluoride，NaF)含量為50 mg/L的自來(lái)水。動(dòng)物室溫度約22 ℃，相對(duì)濕度約60 %；兩組大鼠飼養(yǎng)6月時(shí)，觀察大鼠氟斑牙形成鑒定染氟是否成功，同時(shí)采取股動(dòng)脈放血方式處死大鼠，收集血細(xì)胞，于-80 ℃保存，測(cè)定MGMT、MLH1 基因 mRNA 水平。

1.2.2氟斑牙檢查采用三度法檢查氟斑牙形成情況[5]。Ⅰ度，門牙表面黃白相間，白奎條紋清晰； Ⅱ度，牙表面呈無(wú)光澤、粉筆樣白色斑; Ⅲ度，牙表面出現(xiàn)小溝、裂紋或部分脫落，牙齒呈鋸齒狀缺損。根據(jù)氟斑牙情況確定動(dòng)物模型復(fù)制是否成功。

1.2.3MGMT及hMLH1 mRNA測(cè)定 采用經(jīng)典Trizol法提取大鼠血細(xì)胞總RNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA濃度以及純度。A260/A280比值在1.9～2.1，取3 μg總RNA按照說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，4 ℃保存。按表1設(shè)計(jì)MGMT、MLH1和內(nèi)參β-actin引物，用 Real Time-PCR 測(cè)定MGMT及hMLH1的 mRNA 的水平。ABI Step One型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀采集待測(cè)基因及內(nèi)參照 β-actin 擴(kuò)增各 40 個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)，以 Applied Biosystems SDS1.4 軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4 軟件分析其 ΔΔCt 值及relative quantity(RQ)值，RQ=2-ΔΔCt。以 β-actin 為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算染氟毒組與對(duì)照組間mRNA和對(duì)照組的相對(duì)水平。 反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1　 MGMT、 MLH1及 β- actin引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1氟斑牙分度

20例對(duì)照組大鼠氟斑牙分度均為0級(jí)，而染氟組均出現(xiàn)不同程度的氟斑牙，其中Ⅰ度6例，Ⅱ度7例，Ⅲ度7例。證明氟中毒大鼠模型復(fù)制成功。

2.2MGMT和MLH1 mRNA表達(dá)

MGMT和MLH1 mRNA 在染氟組大鼠中表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1及圖2。

注：A為MLH1，B為MGMT，C為β-antin 圖1　MGMT和MLH1基因熔解曲線與循環(huán)圖(Real Time-PCR) Fig.1　The melting curve and circular fluorescent signal of MGMT and MLH1 gene

(1)與對(duì)照組相比,P<0.05 圖2　兩組大鼠血液樣本 MGMT和MLH1基因 mRNA 表達(dá)水平 Fig.2　The mRNA expression of MGMT and MLH1 in the blood of fluorosis rats

3討論

氟性質(zhì)活潑，氟化物可通過(guò)與哺乳動(dòng)物DNA的共價(jià)結(jié)合而造成DNA損傷，如DNA單鏈斷裂、 DNA氧化損傷及程序外合成DNA等[5]。一般情況下，任何的DNA損傷，只要修復(fù)無(wú)差錯(cuò)，則損傷不會(huì)發(fā)生，此過(guò)程依賴于生物體細(xì)胞內(nèi)修復(fù)系統(tǒng)的完整與穩(wěn)定，如果修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)了問(wèn)題，損傷得不到有效和及時(shí)的糾正，就可能導(dǎo)致DNA損傷引起的突變。所以，損傷的最終結(jié)果是修復(fù)與損傷共同作用、相互平衡所造成的，氟所造成的損傷有可能是加強(qiáng)了對(duì)DNA的損傷，也有可能是破壞了修復(fù)系統(tǒng)，或者兩者皆有。

DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)是生物進(jìn)化過(guò)程中的保守基因，具有修復(fù)DNA錯(cuò)配、維持基因組穩(wěn)定降低自發(fā)性突變的功能，這一系統(tǒng)由一系列具有特異修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配功能的酶分子組成[6-7]，MLH1基因是錯(cuò)配修復(fù)基因中較為重要的基因，它擔(dān)負(fù)著對(duì)錯(cuò)配位點(diǎn)的識(shí)別和切除的功能，其功能缺陷使DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)配難以得到有效修復(fù)[8-10]。MGMT是一種高效的DNA直接修復(fù)酶，能修復(fù)DNA序列中的6-O- 甲基鳥嘌呤即烷化基團(tuán)對(duì)細(xì)胞 DNA的損傷，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用，尤其與DNA烷基化損傷的修復(fù)密切相關(guān)，這是一種迅速的、直接的修復(fù)方式，在 DNA損傷修復(fù)的早期發(fā)揮了重要的作用[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，慢性氟中毒大鼠血細(xì)胞MGMT、MLH1基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，提示過(guò)量氟有可能抑制MGMT、MLH1基因的表達(dá)，影響了機(jī)體的DNA錯(cuò)配修復(fù)功能和烷基化基團(tuán)對(duì)細(xì)胞DAN損傷的修復(fù)，導(dǎo)致DNA損傷，這可能是氟引起DNA損傷的分子機(jī)制之一。

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(2015-06-23收稿，2015-08-20修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅