益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的鑒別和橙皮苷含量的測定

益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的鑒別和橙皮苷含量的測定*

**通信作者 E-mail:yanyu626@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2322.064.html

譚丹1， 朱迪1， 陸苑1, 2， 王愛民1,3， 黃躍偉4， 李勇軍1, 3， 蘭燕宇1, 3**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽550004； 4.貴州德良方藥業(yè)股份有限公司， 貴州 興義562409)

[摘要]目的： 建立益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的薄層色譜鑒別與橙皮苷含量的測定方法。方法: 采用薄層色譜法對陳皮的定性鑒別，采用高效液相色譜法測定橙皮苷的含量；色譜柱為迪馬 C18柱(150×4.6，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(20∶80)，流速1 mL/min，柱溫45 ℃，檢測波長283 nm。結(jié)果： 薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾；橙皮苷進(jìn)樣量為0.114 ～2.29 μg，與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 4)，平均回收率為99.67%，平均峰面積(RSD)為2.1%。結(jié)論： 所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的鑒別和橙皮苷的含量測定。

[關(guān)鍵詞]色譜法，薄層； 益腎養(yǎng)元顆粒； 陳皮； 色譜法，液相； 橙皮苷

[基金項目]*貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目[黔科合中藥字(2013)5062號，黔科合重G字(2013)4001]; 貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計劃[黔教合協(xié)同創(chuàng)新字(2013)04]

[中圖分類號]R927.2

Identification ofPericarpiumcitrireticulataein Yishenyangyuan Granules

with TLC and Determination of Hesperidin Content with HPLC

TAN Dan1, ZHU Di1, LU Yuan1,2, WANG Aimin1,3, HUANG Yuewei4, LI Yongjun1,3, LAN Yanyu1,3

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouProvincialKey

LaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.Engineering

ResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,Ministryof

Education,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.GuizhouDe

LiangfangPharmaceuticalCo.Ltd.,Xingyi562409,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To establish the method for the identification of Pericarpium citri reticuLatae in Yishenyangyuan granules and the hesperidin content determination. Methods: Pericarpium citri reticulatae were identified by TLC and the content of hesperidin was determined by HPLC. A Diamonsil C18 column (150 mm×4.6 mm,5 μm) was used with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% phosphoric acid (20∶80) at a flow rate of 1.0 mL/min, the column temperature was 45 ℃ and the detection wave length was 283 nm. Result: The bilirubin spot of TLC were clear, and there was no interference in negative control. The sample size of hesperidin was in the range of 0.114～2.29 μg, demonstrating a good linear relationship with the peak area (r=0.999 4). The average recovery rate was 99.67%, and RSD was 2.1%. Conclusion: The above established methods were simple and accurate with good reproducible characteristic, which can be used for the identification of Pericarpium citri reticulatae and content determination of hesperidin in Yishenyangyuan granules.

[Key words] chromatography, thin layer; Yishenyangyuan granules;Pericarpiumcitrireticulatae; chromatography,liquid; hesperidin

益腎養(yǎng)元顆粒系由制何首烏、狗脊、黃精、陳皮等八味中藥經(jīng)提取加工制成的顆粒劑，具有補(bǔ)益肝腎、健脾益氣、澀精止遺的功效，臨床用于治療肝腎不足、脾氣虛弱、面色萎黃、倦怠納差、腰膝酸痛、遺精夢泄等癥[1-2]。益腎養(yǎng)元顆粒中的陳皮具有治療脘腹脹滿，食少吐泄等癥，所含黃酮類化合物為其主要成分[3-6]。目前尚未建立益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的鑒別以及橙皮苷的含量測定方法。為了進(jìn)一步提高益腎養(yǎng)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床患者用藥的安全有效，對益腎養(yǎng)元顆粒中陳皮的TLC鑒別和含量測定進(jìn)行研究，建立益腎養(yǎng)元顆粒中的陳皮的TLC鑒別和橙皮苷的含量測定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器

ULtiMate 3000高效液相色譜儀、四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、色譜柱溫箱、陣列二極管檢測器，變色龍6.8色譜工作站(賽默飛世爾科技有限公司)，安捷倫Chemstation B.04.03色譜工作站(處理色譜數(shù)據(jù)用)，METTLER AE240電子天平[梅特勒-脫利多儀器(上海)有限公司]，REPROSTAR3薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士GAMAG)，ZF-401型可見紫外檢測儀(上海顧村電光儀器廠)，實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2藥物

橙皮苷對照品(批號110721-200613，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定研究所)和陳皮對照藥材(批號120969-201109),均購于中國食品藥品檢定研究院，甲苯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇為分析純，水為超純水，聚酰胺(30～60目)、硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；益腎養(yǎng)元顆粒11批由貴州德良方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

2方法與結(jié)果

2.1陳皮薄層色譜鑒別

取益腎養(yǎng)元顆粒2 g，研細(xì)，加70%乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL微熱溶解，用正丁醇提取2次，每次15 mL；合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇3 mL溶解，加0.5 g聚酰胺(30～60目)拌勻，水浴上揮去乙醇，加于聚酰胺柱(30～60目， 1 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用30 mL水洗脫，棄去水液；再用25 mL 30%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材0.1 g，同法制成陳皮對照藥材溶液。取除陳皮外的其余成分按同法制成缺陳皮陰性對照液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，對照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，成條帶狀，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，見圖1。方法考察：將提取1 h后的樣品加入甲醇再次回流1 h，將提取液濃縮后照“2.1”所述薄層色譜條件檢測是否還有橙皮苷存在，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，幾乎沒有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖2。

注：1為缺陳皮陰性樣品，2～4為供試品，5為陳皮對照藥材 圖1　各樣品中陳皮薄層色譜 Fig.1　TLC chromatograms of citrus in Yishenyangyuan granules

2.2橙皮苷含量測定

2.2.1對照品、供試品以及陰性對照溶液的制備精密稱取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每0.1 g/L的溶液，即得對照品溶液。取裝量差異項下的本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL，蒸至近干，殘渣用甲醇適量溶解并定容至2 mL，搖勻，即得供試品溶液。取缺陳皮陰性對照，按照“2.2.1”項供試品溶液制備方法制備缺陳皮陰性對照溶液。

2.2.2色譜條件色譜柱為迪馬 C18 色譜柱(150×4.6，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(20∶80)，流速1 mL/min，柱溫45 ℃；檢測波長283 nm，進(jìn)樣5 μL。理論板數(shù)以橙皮苷峰計算應(yīng)不低于7 000。

2.2.3專屬性試驗(yàn)按照擬定的色譜條件吸取對照品溶液、供試品溶液和缺陳皮的陰性對照液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明供試品色譜中，在與對照品色譜峰相應(yīng)峰時處有色譜峰，且與相鄰雜質(zhì)峰充分分離；陰性對照無干擾，表明該方法專屬性較好，見圖3。

注：A為橙皮苷對照品，B為供試品，C為陰性對照，1為橙皮苷 圖3　橙皮苷HPLC色譜 Fig.3　HPLC chromatograms of hesperidin in Yishenyangyuan granules

2.2.4線性關(guān)系考察分別用自動進(jìn)樣器吸取每1 mL含0.114 4 mg橙皮苷對照品溶液1、3、5、7、10、15和20 μL，注入液相色譜儀中，測定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，得線性回歸方程為：Y=1 394.9X-46.3，r=0.999 4(Y為峰面積，X為進(jìn)樣量)，結(jié)果表明橙皮苷進(jìn)樣量在0.114～2.29 μg時線性關(guān)系良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品約2 g，9份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法分別制備9份供試品溶液，分別精密吸取5 μL注入高效液相色譜儀，結(jié)果顯示，供試品取樣量在1.5～2.5 g時，平均含量為0.285 mg/g，RSD為2.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6精密度試驗(yàn) 取同一供試品，按供試品溶液制備方法制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5 μL。結(jié)果顯示，供試品溶液中橙皮苷平均峰面積(RSD)為0.59%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品，按供試品溶液制備方法制備供試液，分別于0、1、4、8、16 h進(jìn)樣5 μL，測定峰面積，結(jié)果顯示，供試品溶液中橙皮苷RSD為0.59%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8回收率試驗(yàn)精密稱取已知橙皮苷含量(0.285 9 mg/g)的樣品共9份，每份約1 g，分別按所取樣品量中橙皮苷量的50%、100%和150%精密加入對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備供試液，測定并計算橙皮苷的回收率，見表1。

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9制劑中橙皮苷含量測定精密稱取本品11批樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積， 計算樣品中橙皮苷含量。 11批制劑中橙皮苷的含量測定結(jié)果見表2。

表2　益腎養(yǎng)元顆粒中橙皮苷含量測定

3討論

陳皮的定性鑒別樣品制備曾采用甲醇提取[7-8],甲醇提取后用正丁醇或乙酸乙酯萃取等方法[9]，均未取得較好鑒別效果。最后采用甲醇提取后正丁醇萃取，繼用聚酰胺富集的方法制備樣品進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明，制劑和對照藥材有多個斑點(diǎn)對應(yīng)，顯色清晰，陰性對照無干擾，經(jīng)多批次試驗(yàn)，均能較好重現(xiàn)。

制劑中陳皮藥材為提取物，其所含的橙皮苷溶解于甲醇中[10]，因此試驗(yàn)采用以甲醇為溶劑加熱回流提取制劑中的橙皮苷，經(jīng)薄層鑒別考察，采用甲醇加熱回流提取1 h可將制劑樣品中橙皮苷提取完全。

益腎養(yǎng)元顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別項收載了何首烏、狗脊、金櫻子、補(bǔ)骨脂的薄層色譜鑒別，含量測定項收載了何首烏中大黃素的高效液相色譜法測定。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心的補(bǔ)充資料通知，為了進(jìn)一步提高益腎養(yǎng)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究，增加了制劑中陳皮的薄層色譜鑒別和橙皮苷的高效液相含量測定方法，以使質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)更趨完善，更有效地控制了益腎養(yǎng)元顆粒的質(zhì)量。

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(2015-04-12收稿，2015-08-19修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華