人參莖葉總皂苷對(duì)D－半乳糖致衰老小鼠腦組織的抗氧化作用

人參莖葉總皂苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織的抗氧化作用

劉佳陳丹娜曾琛張敬敬

(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410219)

摘要〔〕目的探討人參莖葉總皂苷(GSLS)對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化的作用。方法GSLS分低、中、高個(gè)劑量組：7.5、30、120 mg·kg-1·d-1給小鼠灌胃，模型組和空白組為生理鹽水灌胃；除空白組注射生理鹽水外，其他組每天頸背部皮下注射D-半乳糖制備亞急性衰老模型；連續(xù)42 d進(jìn)行灌胃和注射。觀察和測(cè)定小鼠體重等基本生命狀態(tài)，Morris水迷宮法檢測(cè)小鼠的認(rèn)知能力，比色法測(cè)定小鼠全腦組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA) 含量，考察GSLS在腦中的抗氧化性能。結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，全腦組織SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，GSLS灌胃中劑量組逃避潛伏期縮短(P<0.05)，GSLS中、高劑量給藥可增加腦組織SOD活性(P<0.01和P<0.05)、中劑量GSLS可減少M(fèi)DA含量(P<0.01)。低劑量GSLS對(duì)小鼠腦組織SOD活性和MDA含量無明顯影響。結(jié)論GSLS在一定劑量下對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠認(rèn)知能力減退具有改善作用，可能與提高衰老小鼠的抗氧化能力有關(guān)。其中30 mg·kg-1·d-1為最佳用量，120 mg·kg-1·d-1灌胃42 d可能存在一定毒性。

關(guān)鍵詞〔〕人參莖葉總皂苷；抗氧化；衰老；D-半乳糖

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(11C0135)

通訊作者：陳丹娜(1977-)，女，博士，講師，主要從事中藥生物特性研究。

第一作者：劉佳(1979-)，女，碩士，講師，主要從事抗衰老的生物機(jī)制研究。

人參既可對(duì)抗機(jī)體衰老，也可延緩腦衰老〔1〕。前者已被現(xiàn)在很多科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔2〕，但人參抗腦衰老需要進(jìn)一步驗(yàn)證，而且腦老化可能為腦細(xì)胞凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、衰老基因表達(dá)、氧自由基損傷等多種內(nèi)外因素所致，人參通過何種方式延緩腦老化尚且有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)先證實(shí)了人參莖葉總皂苷(GSLS)對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠〔3〕腦組織的保護(hù)作用，然后探討GSLS的抗氧化能力。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，體重(22±2)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，批號(hào)43004700000750，長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院湖南省重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物室飼養(yǎng)。GSLS含量≥80%UV，購自吉林省宏久生物科技公司。D-半乳糖購自Genview公司。超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒和丙二醛(MDA) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20120315，20120914，20120602；其他化學(xué)試劑均為分析純。Morris水迷宮，西班牙Panlab公司生產(chǎn)。722型分光光度計(jì)，產(chǎn)自上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及給藥40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為5組：空白組，模型組，GSLS低、中、高劑量組7.5、30及120 mg·kg-1·d-1，每組8只，自由攝食和飲水。每天稱重，實(shí)驗(yàn)組按體重灌胃GSLS，空白組和模型組按照5 ml·kg-1·d-1生理鹽水灌胃。除空白組外，其他組頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1制備亞急性衰老小鼠模型，空白組注射同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃和注射42 d后檢測(cè)小鼠的認(rèn)知能力，處死小鼠，測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.3 Morris水迷宮檢測(cè)

1.3.1 定向航行實(shí)驗(yàn)加藥第38天開始訓(xùn)練4 d，每天上、下午各一輪，將小鼠從Morris水迷宮4個(gè)象限入水點(diǎn)面向水池壁放入水中，記錄小鼠找到透明有機(jī)玻璃平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。若超過2 min未找到平臺(tái)，引導(dǎo)其到平臺(tái)上站立15 s。第5天(加藥第42天)檢測(cè)逃避潛伏期，超過2 min未找到平臺(tái)，潛伏期記為120 s。

1.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)第5天(加藥第42天，加藥后2 h)撤除平臺(tái)，然后將小鼠任選入水點(diǎn)放入水中，測(cè)其120 s內(nèi)游過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)(跨平臺(tái)次數(shù))。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定于末次給藥后6 h稱量小鼠體重，脫頸椎處死,冰上迅速取出全腦組織，生理鹽水沖洗后剪碎后置玻璃勻漿器中，加9倍體積預(yù)冷生理鹽水，制成10%(W/V) 的腦組織勻漿。3 000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說明書測(cè)定腦組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 GSLS對(duì)小鼠表現(xiàn)狀態(tài)和體重的影響與空白組相比，模型組、GSLS低劑量組和中劑量組小鼠的飲食情況、大小便情況、毛發(fā)狀態(tài)和精神狀態(tài)均無異常，體重總體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，與空白組無顯著差異，以此證明D-半乳糖致衰老過程中，小鼠并無明顯的體重變化；而GSLS高劑量組小鼠體重波動(dòng)幅度較大，用藥第1周即出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢，后緩慢增加；在第32～42天出現(xiàn)活動(dòng)較少、攝食減少、毛發(fā)易豎立、易激惹等表現(xiàn)，體重增長(zhǎng)速度與其他組出現(xiàn)差異(圖1)。

圖1　不同劑量GSLS灌胃42 d對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)的影響

2.2 GSLS對(duì)衰老小鼠認(rèn)知能力的影響 由表1可知，模型組小鼠的定向航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(t=2.50,P=0.041)，空間探索實(shí)驗(yàn)中該組小鼠跨原平臺(tái)次數(shù)則少于空白組(t=2.42,P=0.046)，說明衰老造模成功。與模型組相比，GSLS中劑量組小鼠更快找到平臺(tái)，逃避潛伏期縮短(t=2.53,P=0.039)，而跨原平臺(tái)次數(shù)各劑量組與模型組的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　GSLS對(duì)衰老小鼠認(rèn)知能力的影響

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3 GSLS對(duì)衰老小鼠腦組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響由表2可知，模型組小鼠的腦組織SOD(t=3.20,P=0.015)和GSH-Px活性顯著低于空白組(t=2.66,P=0.032)，模型組小鼠MDA含量則顯著高于空白組(t=3.90,P=0.006)，提示衰老模型小鼠腦組織抗氧化能力下降。與模型組相比，GSLS中劑量組(t=4.462,P=0.003)和高劑量組SOD(t=3.02,P=0.019)活性顯著升高，而中劑量組MDA含量降低(t=3.78,P=0.007)。GSLS各劑量組的GSH-Px活性與模型組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　GSLS對(duì)衰老小鼠腦組織中SOD、

與空白組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

3討論

針對(duì)衰老現(xiàn)象，有很多學(xué)說，例如基因突變學(xué)說、端粒學(xué)說、氧自由基學(xué)說、免疫功能下降學(xué)說等〔4〕。氧化自由基學(xué)說是目前比較公認(rèn)的學(xué)說之一。生物體進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)，時(shí)刻產(chǎn)生著自由基，同時(shí)又具有有效的自由基清除酶催化系統(tǒng)(如SOD、GSH等)，使體內(nèi)自由基維持在正常水平。隨著年齡的增長(zhǎng)，這種平衡逐漸被破壞，造成自由基的過剩。過量自由基可通過過氧化作用攻擊細(xì)胞膜、線粒體膜等膜性結(jié)構(gòu)及核酸、蛋白質(zhì)和酶類等生物大分子，引起膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物。生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而功能喪失，最終導(dǎo)致機(jī)體的衰老〔5〕。過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一便是MDA，因此它可以間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和衰老程度。

本實(shí)驗(yàn)水迷宮檢測(cè)證實(shí)了一定劑量的GSLS對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠的認(rèn)知能力減退具有改善效果，但過高劑量、過低劑量卻沒有這個(gè)效果，說明GSLS在短時(shí)間內(nèi)可能對(duì)小鼠認(rèn)知能力的提升作用不夠穩(wěn)定或不太顯著，也可能與該實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限有關(guān)。與此同時(shí)，高劑量組和中劑量組腦組織的SOD活性增高，氧化代謝產(chǎn)物MDA含量則顯著下降，由此可確定人參皂苷可以提高衰老小鼠的抗氧化能力，降低過氧化代謝物積累。兩者綜合考慮，可以認(rèn)為抗氧化作用必須累積到一定程度，生物的認(rèn)知能力才會(huì)出現(xiàn)顯著地提高。另外需要注意的是，產(chǎn)生抗衰老效果必須較長(zhǎng)期服用GSLS，并且必須在一定劑量下，實(shí)驗(yàn)中可看出劑量過低無效，而高劑量組小鼠毛發(fā)易豎立、較容易反應(yīng)過激等表現(xiàn)提示其神經(jīng)興奮性常高于正常值，體重下降則提示也許已出現(xiàn)毒副作用，高劑量GSLS影響了小鼠的健康，也許間接解釋了該組小鼠的認(rèn)知能力沒有改善的原因。過量使用人參出現(xiàn)毒性反應(yīng)也不乏有報(bào)道〔6〕，提示人們心目中的“中藥圣品”并非是完全安全。

4參考文獻(xiàn)

1陳兆耀，劉新峰，徐格林.人參皂苷改善認(rèn)知功能作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(24)：4980-2.

2雷秀娟，馮凱，孫立偉，等.人參皂苷抗衰老機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.氨基酸和生物資源，2010;32(1)：44-7.

3李樹梅，盧勝明，康峰,等.衰老動(dòng)物模型的研究進(jìn)展及應(yīng)用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(19)：3869-72.

4李國(guó)林，印大中.近代衰老理論研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008;28(8)：824-7.

5龐軍，甘煒，唐宏亮，等.中醫(yī)非藥物療法抗自由基延緩衰老的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展〔J〕.廣西中醫(yī)藥，2010;33(1)：6-8.

6 杜迎剛，苗青.人參安全食效性研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008;36(25)：10954-5.

〔2013-11-30修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)