前列腺干細(xì)胞抗原基因和磷脂酶CE1基因多態(tài)性與老年幽門(mén)螺旋桿菌感染胃潰瘍的易感性及對(duì)臨床預(yù)后的影響

前列腺干細(xì)胞抗原基因和磷脂酶CE1基因多態(tài)性與老年幽門(mén)螺旋桿菌感染胃潰瘍的易感性及對(duì)臨床預(yù)后的影響

盧燕劉麗鳳曾莎蘆莉1陶惠敏

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城252000)

摘要〔〕目的探討前列腺干細(xì)胞抗原基因(PSCA)和磷脂酶(PL)CE1基因多態(tài)性與老年幽門(mén)螺旋桿菌(Hp)感染胃潰瘍的易感性及對(duì)臨床預(yù)后的影響。方法采用病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，選取130例胃潰瘍并且Hp檢查為陽(yáng)性的老年患者作為病例組，另外按性別和年齡匹配的胃潰瘍并且Hp檢查為陰性的老年患者作為對(duì)照組。所有患者治療前抽取外周靜脈血并提取DNA，設(shè)計(jì)PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA 測(cè)序分析PSCA和PLCE1基因類(lèi)型，采用Logistic回歸計(jì)算校正相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)評(píng)價(jià)PSCA和PLCE1基因多態(tài)性與老年Hp感染胃潰瘍的易感性。結(jié)果①兩組年齡、性別、病程、病變部位差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；②與rs2294008基因型CC比較，基因型為CT、TT和CT/TT的患者Hp感染危險(xiǎn)性降低(P<0.01)；③與PLCE1 rs11599672基因型AA比較，基因型為AC、CC和AC/CC的患者Hp感染危險(xiǎn)性降低(P<0.05)；④不同PSCA多態(tài)位點(diǎn)rs2294008和LCEl多態(tài)位點(diǎn)rs11599672患者的Hp根除率和潰瘍愈合率差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)SCA rs2294008基因型CC和PLCE1 rs11599672基因型AA可增加Hp感染胃潰瘍易感性，并且顯著降低臨床預(yù)后。

關(guān)鍵詞〔〕幽門(mén)螺旋桿菌感染；胃潰瘍；基因多態(tài)性；前列腺干細(xì)胞抗原基因；磷脂酶CE1

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R573.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)(No.ZR2014HL019)

通訊作者：曾莎(1980-)，女，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事腫瘤、免疫研究。

1聊城市復(fù)退軍人醫(yī)院

第一作者：盧燕(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)鏡下的各種病變?cè)\治，炎癥性腸病及消化道腫瘤診治研究。

幽門(mén)螺旋桿菌(Hp)具有高感染性，是胃黏膜病變的重要致病因素。Hp可引起胃腸道的持續(xù)感染并誘發(fā)持續(xù)的輕度炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致慢性胃潰瘍，并且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)〔1〕。此外，Hp感染與動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病等有顯著相關(guān)性〔2〕。Hp致病機(jī)制復(fù)雜，與Hp易感性有關(guān)的人類(lèi)基因也被不斷報(bào)道〔3〕。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是疾病易感性差異的遺傳基礎(chǔ)，作為常見(jiàn)的遺傳標(biāo)志已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后評(píng)價(jià)的相關(guān)性研究。最近的全基因關(guān)聯(lián)研究報(bào)道了前列腺干細(xì)胞抗原基因(PSCA)和磷脂酶(PL)CE1基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系，但是關(guān)于PSCA和PLCE1基因多態(tài)性與Hp感染胃潰瘍的易感性和臨床預(yù)后卻鮮有報(bào)道。本文探討PSCA和PLCE1與Hp感染胃潰瘍易感性和臨床預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2014年12月我院消化內(nèi)科確診為胃潰瘍并且Hp檢查為陽(yáng)性的130例老年患者為病例組及按年齡和性別匹配確診為胃潰瘍并且Hp檢查為陰性的130例老年患者為對(duì)照組。兩組年齡、性別、病程、病變部位差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1　兩組臨床資料比較

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)胃潰瘍?cè)\斷經(jīng)胃鏡檢查及病理學(xué)確診；Hp檢查以測(cè)定胃鏡檢查時(shí)取的活檢標(biāo)本分別行快速尿素酶試驗(yàn)、組織學(xué)檢查，兩者均為陽(yáng)性者作為Hp感染陽(yáng)性，兩者均為陰性為Hp感染陰性。

1.3納入排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為首診；②符合胃潰瘍?cè)\斷標(biāo)準(zhǔn)；③符合Hp感染陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胃潰瘍病史或治療史的患者；②合并活動(dòng)性出血、穿孔或幽門(mén)梗阻的患者；③治療前4w內(nèi)服用過(guò)質(zhì)子泵抑制或H2受體拮抗劑、鉍劑、抗生素藥物的患者；④并發(fā)嚴(yán)重心、腦、肝、腎和造血系統(tǒng)疾病患者。

1.4SNP測(cè)定方法治療前抽取外周靜脈血于EDTA抗凝管，提取DNA，設(shè)計(jì)PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA測(cè)序分析基因型進(jìn)行PSCA和PLCE1基因多態(tài)性測(cè)定。

1.4.1DNA的提取、測(cè)定與調(diào)整采用QIAGENDNA抽提試劑盒(德國(guó)TAINGEN公司)進(jìn)行血液DNA提取。取所提取的基因組DNA2μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，1%瓊脂糖溴乙錠染色，使用紫外反射透射分析儀(上海金鵬)對(duì)凝膠照相以觀(guān)察DNA的完整性。采用紫外可見(jiàn)分光光度儀(德國(guó)Eppendorf公司)測(cè)定所提取基因組DNA的濃度和純度，標(biāo)本均滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)值OD260nm/OD280nm=1.7～2.0，根據(jù)估計(jì)的濃度將樣本DNA的濃度稀釋到工作濃度5～10ng/μl，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2PCR反應(yīng)以基因組序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)PCR引物，各引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：PCR反應(yīng)總體系為25μl，含100μg/LDNA模板2μl，10×緩沖液215μl，25mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTP2μl，10μmol/L引物正反向各1μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.25μl，滅菌蒸餾水至25μl。反應(yīng)在A(yíng)BI9700PCR儀(美國(guó)ABI公司)中進(jìn)行，條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物2μl并以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，然后GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Syngene公司)中掃描分析結(jié)果。

表1　引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4.3SNP分型利用蝦堿性磷酸酶(美國(guó)SEQUENOM公司)去除PCR后剩余的dNTP，以保證單堿基延伸的準(zhǔn)確性，并且經(jīng)離子交換樹(shù)脂(美國(guó)SEQUENOM公司)純化。96孔板中加入1μl上述純化延伸產(chǎn)物、GenescanTM-120LIZSizeStandard(美國(guó)AppliedBiosystems公司) 0.5μl和去離子甲醜胺8.5μl混合均勻后，95℃變性5min，然后在A(yíng)BIPRISMTM3700DNAAnalyzer(美國(guó)AppliedBiosystems公司)上使用儀器默認(rèn)的3700 測(cè)序程序進(jìn)行電泳、掃板。采用GeneMapper4.1(美國(guó)AppliedBiosystems公司)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析。

1.5胃潰瘍臨床療效評(píng)價(jià)胃潰瘍并且Hp檢查為陽(yáng)性的患者接受PPI法(奧美拉唑20mg+克拉霉素0.5g+阿莫西林1.0g)，2次/d，口服1w，然后繼續(xù)進(jìn)行4w正規(guī)抗?jié)冎委?PPI聯(lián)合胃黏膜保護(hù)劑)，停藥1個(gè)月后復(fù)查胃鏡，觀(guān)察分析患者Hp根除率及潰瘍愈合率。Hp復(fù)查為陰性則為Hp根除，Hp根除率(%)=(治療后Hp陰性患者數(shù)量/患者總數(shù))×100%。潰瘍愈合標(biāo)準(zhǔn)如下：潰瘍及周?chē)仔苑磻?yīng)全部消失為痊愈；潰瘍愈合、潰瘍周?chē)园橛醒装Y為顯效；潰瘍大小(直徑)縮小≥50%為有效；潰瘍縮小<50%或無(wú)變化或增大者為無(wú)效。潰瘍愈合總有效率(%)=〔(治愈+顯效+有效)/患者總數(shù)〕×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，多因素Logistic回歸計(jì)算OR值及其95%CI以表示相對(duì)危險(xiǎn)度。

2結(jié)果

2.1PSCA基因多態(tài)性對(duì)Hp感染易感性的分析PSCA多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率在病例組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)，說(shuō)明選取的樣本具有代表性。病例組PSCA多態(tài)位點(diǎn)rs2294008基因類(lèi)型CC、CT和TT分布頻率與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。多因素Logistic回歸分析，調(diào)整年齡、性別、病程、病變部位等變量后，與rs2294008基因型CC比較，基因型為CT、TT和CT/TT的患者Hp感染危險(xiǎn)性降低(P<0.01)。

表2　 PSCA基因多態(tài)性與 Hp感染的關(guān)系〔n(%),n=130〕

2.2PLCE1基因多態(tài)性對(duì)Hp感染易感性分析PLCE1多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率在兩組均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)。病例組PLCE1多態(tài)位點(diǎn)rs11599672基因類(lèi)型AA、AC和CC分布頻率與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。多因素Logistic回歸分析，調(diào)整年齡、性別、病程、病變部位等變量后，與PLCE1rs11599672基因型AA比較，基因型為AC、CC和AC/CC的患者Hp感染危險(xiǎn)性降低(P<0.05)。

2.3PSCA和LCEl基因多態(tài)性對(duì)Hp根除和潰瘍愈合率的關(guān)聯(lián)性分析經(jīng)治療后，病例組Hp根除率為76.92%，潰瘍愈合率為82.31%。不同PSCA多態(tài)位點(diǎn)rs2294008和LCEl多態(tài)位點(diǎn)rs11599672患者的Hp根除率和潰瘍愈合率差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表3　 PLCEl基因多態(tài)性與 Hp感染的關(guān)系〔n(%),n=130〕

表4　 PSCA和 LCEl基因多態(tài)性對(duì) Hp根除和潰瘍愈合率的關(guān)聯(lián)性分析〔n(%)〕

3討論

Hp是全球性高感染率的慢性感染性致病菌〔4〕。中國(guó)屬Hp高感染率國(guó)家，其感染率為40%～70%，與氣候、居住環(huán)境、飲食、家族遺傳等因素密切相關(guān)〔5〕。Hp感染是引起消化性潰瘍的重要病因，在十二指腸潰瘍中檢出率為95%～100%，在胃潰瘍中檢出率為70%～85%〔6〕。Hp感染既是消化性潰瘍發(fā)病及復(fù)發(fā)的主要因素，同時(shí)也是胃癌的重要危險(xiǎn)因子之一〔7〕。Hp可分泌分泌CagA蛋白等細(xì)胞毒性蛋白，CagA蛋白能參與激活核因子κB通路，導(dǎo)致各種炎癥介質(zhì)增多，從而誘發(fā)胃黏膜炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生，甚至誘發(fā)胃黏膜組織癌變〔8〕。消化性胃潰瘍可能是胃癌重要的癌前狀態(tài)。

PSCA是前列腺癌診斷和判斷預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)〔9〕。PSCA也可在胰腺癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌等高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)〔10〕。有研究〔11〕顯示，PSCA表達(dá)與胃癌侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示PSCA表達(dá)可能是反映胃癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要標(biāo)記物。PLCE1是磷脂酶C的蛋白質(zhì)家族的成員，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用，可通過(guò)催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇和二酯酰甘油。另外，PLCE1包含幾個(gè)Ras相互作用的區(qū)域〔12〕，可與ras原癌基因相互作用，同時(shí)結(jié)合Ras家族鳥(niǎo)苷三磷酸酶，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和血管生成，與動(dòng)物皮膚、腸道腫瘤的形成有關(guān)〔13〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明PSCArs2294008基因型CC和PLCE1rs11599672基因型AA可增加Hp感染胃潰瘍易感性的風(fēng)險(xiǎn)。PSCA和PLCE1基因多態(tài)性影響胃潰瘍患者的臨床預(yù)后，PSCArs2294008基因型CC和PLCE1rs11599672基因型AA可顯著降低胃潰瘍的臨床預(yù)后。

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〔2014-07-17修回〕

(編輯苑云杰)