同源異型盒基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移侵襲中的作用

同源異型盒基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移侵襲中的作用

劉鵬冉雯雯1吳澤玉2倫鵬2孟慶海1

(青島市黃島區(qū)第二人民醫(yī)院，山東青島266400)

摘要〔〕目的研究同源異型盒基因(HOXA5)在膠質(zhì)瘤增殖及遷移侵襲中的作用。方法采用shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建HOXA5低表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，通過MTT，Transwell和Matrigel方法研究干擾HOXA5表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響。結(jié)果與對(duì)照組細(xì)胞相比，干擾HOXA5表達(dá)后能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)侵襲能力(P<0.01)。結(jié)論HOXA5可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，其機(jī)制與促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲遷移有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕膠質(zhì)瘤；同源異型盒基因A5；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

中圖分類號(hào)〔〕R739.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：青島市醫(yī)療衛(wèi)生優(yōu)秀人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助(2015)

通訊作者：孟慶海(1950-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腦腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者：劉鵬(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腦腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

腫瘤呈多因素誘導(dǎo)、多基因參與、多階段發(fā)生的極其復(fù)雜的病理過程，癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是人類腫瘤形成和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)〔1〕。腫瘤的發(fā)生似乎重現(xiàn)了胚胎早期發(fā)育及胚胎畸變的過程，調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，同源異型盒基因(HOXA5)就是其中具有代表性的一個(gè)。HOXA5基因的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其該作用可能通過參與細(xì)胞周期和(或)細(xì)胞凋亡調(diào)控而實(shí)現(xiàn)〔2～4〕。研究顯示，在白血病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌等多種腫瘤中已檢測(cè)到HOXA5的異常表達(dá)〔5～8〕。HOXA5的異常表達(dá)已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但在膠質(zhì)瘤中作用尚不清楚。本研究擬應(yīng)用體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，通過RNA干擾技術(shù)研究HOXA5在膠質(zhì)瘤中的作用及可能的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和抗體膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U373、U251、T98G、SW1088購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型保藏中心，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2，每2 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行傳代及實(shí)驗(yàn)。HOXA5和β-acitn的抗體均購(gòu)自CST。

1.2HOXA5干擾質(zhì)粒及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞系的構(gòu)建根據(jù)pSuper質(zhì)粒說明書的要求，設(shè)計(jì)兩個(gè)與HOXA5 mRNA配對(duì)的核苷酸序列，通過華大公司合成后，退火，克隆至pSuper質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，小提后測(cè)序驗(yàn)證分別命名為pSuper shHOXA5A和pSuper shHOXA5B。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Phinex，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒后感染U251細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，經(jīng)Western印跡和RT-PCR檢測(cè)對(duì)HOXA5干擾效果后應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-PCR常規(guī)按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總的mRNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。應(yīng)用PCR試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)HOXA5的表達(dá)，并用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4Western印跡提取細(xì)胞裂解液，蛋白濃度測(cè)定后通過10% 的SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，分別應(yīng)用相應(yīng)的一抗孵育過夜后，TBST洗3次，每次10 min，室溫下加入相應(yīng)二抗孵育1 h，洗滌后應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，然后顯影、定影。膠片掃描后應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的光密度值。

1.5激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞爬片后甲醛固定，3%H2O2孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，封閉后一抗4℃過夜，PBS沖洗后加入熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS沖洗后封片，Zeiss 7800激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度變化。

1.6MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，用0.25%的胰酶常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，用含有10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×104/ml，分別接種到96孔板中，100 μl/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；另外設(shè)置調(diào)零孔：含有10%FBS的培養(yǎng)基，100 μl/孔；將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱，在37℃，5% CO2及飽和濕度環(huán)境下，分別培養(yǎng)1，2，3，4 d后，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)；將上清去掉，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，OD值570nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.7細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用D-Hanks和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/ml；在Transwell的下室(即24孔板底部)加入800 μl含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)48 h；用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μl甲醇的孔中，室溫固定30 min；取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800 μl Giemsa染液的孔中，室溫染色30 min；在清水浸泡數(shù)次，取出chamber，吸干上室液體，用濕棉棒小心擦拭上室底部膜表面上的細(xì)胞；小心地用鑷子揭下膜，底面向上晾干，用中性樹膠將膜封片在載玻片上；于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室底部中央垂直加入50 μl稀釋后的Matrigel膠，其余操作過程同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HOXA5的表達(dá)Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于大鼠的正常腦組織中的低表達(dá)狀態(tài)，在5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中HOXA5的表達(dá)呈不同程度的高表達(dá)，其中惡性侵襲程度高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251中表達(dá)顯著增高。見圖1。

2.2shRNA干擾HOXA5的U251細(xì)胞系的構(gòu)建各種方法證實(shí)pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B在蛋白和mRNA水平分別不同程度地干擾掉HOXA5的表達(dá)。見圖2。

2.3干擾HOXA5后U251細(xì)胞增殖能力降低MTT結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞(pSuper)，shRNA干擾HOXA5表達(dá)后的U251細(xì)胞組(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)在48 h、72 h和96 h的細(xì)胞增殖能力顯著降低，表明干擾HOXA5表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。見表1。

圖1　Western印跡檢測(cè)正常腦組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中 HOXA5的表達(dá)

1：空載體；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 Western印跡檢測(cè)

1：空載體；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 RT-PCR檢測(cè)

免疫熒光染色

組別0p4p8h72h96h空載體0.31±0.050.43±0.070.61±0.090.71±0.060.84±0.07pSupershHOXA5A0.29±0.030.41±0.020.43±0.060.45±0.020.50±0.03pSupershHOXA5B0.32±0.060.38±0.050.42±0.070.47±0.030.51±0.02

2.4干擾HOXA5后U251細(xì)胞遷移和侵襲能力降低見圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)和Matrigel實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果表明：相對(duì)于對(duì)照組U251細(xì)胞(pSuper)遷移(53±4)和侵襲能力(37±6)，干擾HOXA5后的U251細(xì)胞(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)的遷移(19±3，22±3)和侵襲能力(17±2，19±3)均不同程度的降低(P<0.01)，表明干擾HOXA5能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。

圖3　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力檢測(cè)(200×)

3討論

HOXA5基因的表達(dá)與腫瘤的相關(guān)性具有自身的特點(diǎn)：在組織器官正常發(fā)育與腫瘤的發(fā)生過程中HOXA5基因的表達(dá)不盡相同；HOXA5基因可能與家族成員之間可能存在一種協(xié)同調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制；HOXA5基因的表達(dá)與細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素之間存在相互作用；HOXA5基因可以影響正常細(xì)胞周期，參與細(xì)胞周期"檢查點(diǎn)"的調(diào)控；此外HOXA5可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用〔9〕。本研究在體外初步研究了HOXA5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)以及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響，為深入研究HOXA5在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中HOXA5表達(dá)升高，表明HOXA5可能與膠質(zhì)瘤具有一定的相關(guān)性，可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)是惡性膠質(zhì)瘤體積擴(kuò)增的主要原因之一，本研究提示膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)的HOXA5可能具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的能力。膠質(zhì)瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其惡性程度的標(biāo)志之一〔10〕，本研究表明高表達(dá)的HOXA5對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力具重要的調(diào)控作用。

4參考文獻(xiàn)

1Zhang H，Chen Z，Wang X，etal.Long non-coding RNA：a new player in cancer〔J〕.J Hematol Oncol，2013；6:37.

2Hershko AY，Kafri T，F(xiàn)ainsod A，etal.Methylation of HoxA5 and HoxB5 and its relevance to expression during mouse development〔J〕.Gene，2003；302(1-2)：65-72.

3Joksimovic M，Jeannotte L，Tuggle CK.Dynamic expression of murine HOXA5 protein in the central nervous system〔J〕.Gene Exp Pattern，2005；5(6)：792-800.

4Tabaries S，Lemieux M，Aubin J，etal.Comparative analysis of Hoxa5 allelic series〔J〕.Genesis，2007；45(4)：218-28.

5Boucherat O，Chakir J，Jeannotte L.The loss of Hoxa5 function promotes Notch-dependent goblet cell metaplasia in lung airways〔J〕.Biol Open，2012；1(7)：677-91.

6Yoo KH，Park YK，Kim HS，etal.Epigenetic inactivation of HOXA5 and MSH2 gene in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Pathol Int，2010；60(10)：661-6.

7Gendronneau G，Boucherat O，Aubin J，etal.The loss of Hoxa5 function causes estrous acyclicity and ovarian epithelial inclusion cysts〔J〕.Endocrinology，2012；153(3):1484-97.

8Rodini CO，Xavier FC，Paiva KB，etal.Homeobox gene expression profile indicates HOXA5 as a candidate prognostic marker in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Int J Oncol，2012；40(4):1180-8.

9Boucherat O，Guillou F，Aubin J.Hoxa5：a master gene with multifaceted roles〔J〕. Med Sci (Paris)，2009;25(1)：77-82.

10Thiery JP，Lim CT.Tumor dissemination：an EMT affair〔J〕.Cancer Cell，2013；23(3):272-3.

〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)