電針對血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸素表達(dá)的影響

電針對血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸素表達(dá)的影響

黃曉江蔣雯雯1賈叢林1胡蔭1王欣1趙晶1韋登明1

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北武漢430030)

摘要〔〕目的觀察電針對血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)突觸素(Syp)表達(dá)的影響。方法SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組10只。在建立 VD 大鼠模型后，電針“百會(huì)”、“大椎”穴,每天1次，留針20 min，連續(xù)治療10 d ，水迷宮觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,TUNEL染色技術(shù)觀察腦組織海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果，免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察腦組織海馬神經(jīng)細(xì)胞Syp表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，經(jīng)電針治療后水迷宮潛伏期明顯縮短(P<0.01),相同時(shí)間內(nèi)在原平臺(tái)象限跨越相應(yīng)平臺(tái)次數(shù)明顯增多 (P<0.01)；海馬TUNEL免疫陽性細(xì)胞積分光密度顯著減少(P<0.05)，海馬Syp免疫陽性細(xì)胞積分光密度顯著增加(P<0.05)。結(jié)論電針大鼠“百會(huì)”、“大椎”穴能改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能與其抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)海馬Syp表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕血管性癡呆；電針；學(xué)習(xí)記憶能力；凋亡；突觸素

中圖分類號〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)

通訊作者：韋登明(1963-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事傳統(tǒng)醫(yī)藥防治腦血管疾病的研究。

1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室

第一作者：黃曉江(1978-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病的防治研究。

海馬是機(jī)體學(xué)習(xí)、記憶的主要功能腦區(qū)，腦缺血導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡〔1,2〕。針灸具有多環(huán)節(jié)作用的特點(diǎn)，可較好地防治血管性癡呆(VD)引起的損傷，改善學(xué)習(xí)、記憶功能〔3,4〕。研究表明〔3,4〕，電針大鼠百會(huì)、大椎穴能改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)海馬蛋白激酶C、谷氨酸及其受體的表達(dá)有關(guān)。而電針大鼠百會(huì)、大椎穴改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及突觸素(Syp)表達(dá)影響的關(guān)系如何，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討電針改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶及其與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和Syp表達(dá)影響的關(guān)系。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組體重200～250 g SD健康大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號0102008，雌、雄不限。按照動(dòng)物飼養(yǎng)條例飼養(yǎng)。根據(jù)隨機(jī)分組原則，分為假手術(shù)組、模型組、電針組,每組10只。

1.2 試劑儀器電針治療儀(G6805-2B，上海華誼醫(yī)用器械廠)；凋亡檢測試劑盒、兔抗大鼠Syp多克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；JD801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技有限公司)；Morris水迷宮(北京新天地科技公司)。

1.3 模型制備分別對模型組和電針組進(jìn)行造模手術(shù)，造模手術(shù)采用王蕊等〔5〕改進(jìn)后的方法造模。用10% 的水合氯醛按照3 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，待實(shí)驗(yàn)大鼠安靜后，腹腔注射(3.5 mg/kg體重)的硝普鈉以達(dá)到低血壓的目的，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min再通10 min，再夾閉10 min，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上，但不阻斷頸總動(dòng)脈及注射硝普鈉。

1.4 電針干預(yù)方法手術(shù)后觀察手術(shù)切口基本愈合，飲食正常，于術(shù)后第7 d開始給予電針治療。對電針治療組進(jìn)行為期10 d的電針治療，將電針治療組動(dòng)物放入大鼠固定器中，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安靜后，參照實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔6〕中大鼠的穴位定位方法取百會(huì)、大椎穴，“百會(huì)” 穴在頂骨的正中，“大椎”穴在背部的正中的第7頸椎與第l胸椎之間，用28號30 mm長毫針，分別在“百會(huì)”“大椎”兩處刺入1.5 mm，進(jìn)行電針治療，施以頻率為50 Hz，強(qiáng)度約1 mA，以大鼠能耐受為度，每天電針治療1次，留針約20 min，按照此方法持續(xù)治療10 d。

1.5 學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測采用Morris水迷宮試驗(yàn)〔7〕，于電針治療結(jié)束時(shí)(即實(shí)驗(yàn)第17天)進(jìn)行檢測。①定位航行試驗(yàn)：歷時(shí)6 d,每天2次,將大鼠固定從第一象限面向池壁放入水中，記錄其2 min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(EL)。逃避潛伏期越短提示大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，反之則越差。②空間探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束后(即實(shí)驗(yàn)第22天)撤除平臺(tái)，將大鼠固定從第一象限放入水中，測其2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)及其在水迷宮外環(huán)停留時(shí)間。大鼠在相同時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)越多，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，反之則越差。由配套電腦系統(tǒng)自動(dòng)記錄成績。

1.6 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測到達(dá)電針治療結(jié)束后的預(yù)定時(shí)間，將大鼠麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)后，進(jìn)行4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH值7.4)灌注固定：暴露心臟后升主動(dòng)脈插管，先用100 ml生理鹽水快速?zèng)_洗，隨后用4%多聚甲醛灌注固定后取海馬腦組織。行石蠟包埋切片，按照武漢博士德公司提供的凋亡檢測試劑盒說明書的操作步驟，用TUNEL染色技術(shù)進(jìn)行海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果判斷：光鏡下海馬神經(jīng)細(xì)胞核呈棕色著色者為陽性細(xì)胞，用JD801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算其積分光密度。

1.7 海馬Syp免疫組化染色觀察石蠟包埋切片，按照SABC免疫組化試劑盒說明書的操作步驟，用SABC免疫組化染色技術(shù)進(jìn)行海馬Syp免疫組化染色觀察。結(jié)果判斷：光鏡下海馬神經(jīng)細(xì)胞上呈棕色著色者為陽性細(xì)胞，用JD801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算其積分光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 電針對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組，而與模型組比較，電針組大鼠平均逃避潛伏期明顯短于模型組(P<0.01)?？臻g探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在平臺(tái)象限跨越次數(shù)明顯少于假手術(shù)組，而與模型組比較，電針組大鼠在平臺(tái)象限跨越次數(shù)明顯多于模型組(P<0.01)，提示模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較假手術(shù)組明顯降低，而給予電針干預(yù)后則可改善治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

2.2 電針對大鼠海馬Syp表達(dá)的影響假手術(shù)組大鼠海馬組織可見一定量的Syp陽性細(xì)胞，主要分布海馬神經(jīng)細(xì)胞上；模型組大鼠腦組織Syp免疫染色陽性細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增多，其免疫染色陽性細(xì)胞積分光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用電針治療后，大鼠腦組織Syp免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組比較有明顯增加，其免疫染色陽性細(xì)胞積分光密度值與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，提示電針治療后則可促進(jìn)VD大鼠海馬Syp的表達(dá)。

2.3 電針對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響假手術(shù)組海馬細(xì)胞見及少數(shù)TUNEL染色陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組比較，模型組海馬見明顯增多的TUNEL染色陽性細(xì)胞，其免疫染色陽性細(xì)胞積分光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)電針治療后，與模型組比較，電針治療組海馬TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，其免疫染色陽性細(xì)胞積分光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示電針治療后則可抑制VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。見表2。

表1　各組水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測結(jié)果 ± s, n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

表2　電針對大鼠腦海馬組織Syp表達(dá)和

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在降低血壓的同時(shí)采用重復(fù)腦缺血再灌注制備的動(dòng)物模型出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能障礙，模型成功模擬了人VD的臨床表現(xiàn)，是較理想的VD動(dòng)物模。突觸數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化均可影響神經(jīng)突觸可塑性，從而影響腦的神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞和學(xué)習(xí)記憶功能。Syp是突觸囊泡的一種特異標(biāo)志性蛋白，它與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，其數(shù)量和分布密度可間接反映突觸的密度〔8〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體大腦出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)，神經(jīng)突觸可代償性增多，Syp表達(dá)也增加〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦缺血再灌注后，神經(jīng)突觸可代償性增多。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程,腦缺血再灌注可導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔1,2〕,本實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測的TUNEL染色結(jié)果，驗(yàn)證了腦缺血再灌注可導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，TUNEL染色結(jié)果。腦缺血時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞存活的數(shù)量和突觸可塑性與腦學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為電針大鼠百會(huì)、大椎穴改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制可能與其抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)海馬神經(jīng)Syp表達(dá)有關(guān)。

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〔2014-01-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)