大劑量當(dāng)歸預(yù)適應(yīng)抗心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

大劑量當(dāng)歸預(yù)適應(yīng)抗心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

陳彥文1明海霞2劉喜平王強(qiáng)1高曉蘭1郭超1趙英1

(甘肅中醫(yī)學(xué)院解剖教研室甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅蘭州 730000)

摘要〔〕目的觀察大劑量當(dāng)歸水煎液預(yù)適應(yīng)對缺血再灌注(IR)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響。方法應(yīng)用離體灌流大鼠心臟，復(fù)制大鼠心肌IR與缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)模型，并以不同大劑量當(dāng)歸水煎液灌胃6 w后，取大鼠心臟進(jìn)行離體灌注，復(fù)制當(dāng)歸IPC模型，以TTC法測定心肌梗死面積，以Tunel法檢測細(xì)胞凋亡，Western印跡法檢測Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果大劑量當(dāng)歸水煎液預(yù)適應(yīng)能有效降低IR大鼠心肌梗死面積，降低心肌細(xì)胞的凋亡率，并增加心肌組織Bcl-2的表達(dá)而抑制Bax的表達(dá)，且呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論大劑量當(dāng)歸水煎液預(yù)適應(yīng)可增加心肌組織Bcl-2的表達(dá)而抑制Bax的表達(dá)，從而減少IR大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，對IR大鼠心肌具有明顯保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕當(dāng)歸水煎液；缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；Bcl-2：Bax

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：甘肅省教育廳

通訊作者：劉喜平(1972-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥復(fù)方配伍及敦煌古醫(yī)方研究。

1甘肅中醫(yī)學(xué)院生理教研室甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室

2甘肅中醫(yī)學(xué)院方劑教研室

第一作者：陳彥文(1969-)，男，副教授，主要從事中西結(jié)合防治心腦血管疾病基礎(chǔ)研究。

心肌缺血是冠心病的基本病理過程，盡早恢復(fù)血供能夠挽救缺血心肌，但再灌注則引起缺血再灌注(IR)損傷。缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)是心肌保護(hù)的新概念，是迄今為止最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌缺血保護(hù)方法。水煎口服是中醫(yī)臨床常見給藥途徑，前期研究表明，大劑量岷當(dāng)歸水煎液預(yù)適應(yīng)可減少或防止大鼠心肌IR室性心律失常的發(fā)生，從而減輕IR心肌損傷，對心肌IR后大鼠心功能具有明顯保護(hù)作用，但其作用機(jī)制不是十分明確〔1〕。本研究對IPC心肌IR大鼠給予不同大劑量當(dāng)歸水煎液治療， 從細(xì)胞凋亡的角度探討大劑量當(dāng)歸對IR損傷的藥理學(xué)預(yù)適應(yīng)作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物SPF級健康成年雄性SD大鼠40只，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心實驗動室提供，實驗設(shè)施使用證SYXK(甘)2009～0006，實驗動物質(zhì)量合格證SCXK(甘)2009～0006。

1.2 藥品及試劑當(dāng)歸藥材由蘭州復(fù)興厚藥材有限公司提供，經(jīng)鑒定符合藥典規(guī)定；當(dāng)歸水煎液采用常規(guī)煎煮方法，濃縮為1 g/ml；TTC染液購自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax福建邁新試劑公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1動物分組及模型建立SD大鼠麻醉同時腹腔注射肝素，隨機(jī)分為5組，每組8只。開胸取心臟置于冷灌流液中，主動脈逆行插管連接在 Langendorff 離體灌流裝置上，以80 mmH2O 的壓力KH緩沖液灌流心臟，用95%O2和5%CO2混合氣體平衡灌流液。

IR組：大鼠心臟先預(yù)灌注平衡 20 min，然后在無灌流液、無氧的條件下，保持心臟溫度恒定在37℃，停止灌流40 min(缺血)，之后再復(fù)灌120 min(再灌)；IPC組 ：大鼠心臟先預(yù)灌注平衡20 min ，再經(jīng)短暫的5 min缺血，10 min 再灌注， 重復(fù)3 次之后，心臟再經(jīng)歷 40 min 的缺血，120 min的再灌注；當(dāng)歸小劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組 ( DL-IPC組) ：給予大鼠當(dāng)歸小劑量水煎液0.54 g/d(相當(dāng)于人劑量的30 g)灌胃給藥6 w后，麻醉動物，迅速取心臟連接到離體心臟灌流裝置上，復(fù)制心臟IPC 模型(方法同IPC組 )；當(dāng)歸中劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組 (DM-IPC) ：給予大鼠當(dāng)歸中劑量水煎液1.08 g/d(相當(dāng)于人劑量的60 g)灌胃給藥，其余操作同DL-IPC組；當(dāng)歸大劑量水煎液+缺血預(yù)適應(yīng)組(DH-IPC)：給予大鼠當(dāng)歸大劑量水煎液2.16 g/d (相當(dāng)于人劑量的120 g)灌胃給藥，其余操作同DL-IPC組。

1.3.2 TTC染色法測定心肌梗死面積心臟灌流結(jié)束后取下心臟，置于-20℃冷凍2 h ，然后，沿從心尖到心底方向，將心臟切成 4 mm厚的切片，將心肌切片置于 2%TTC染液中，37℃孵育20 min，再將切片用10%的甲醛溶液固定。鏡檢觀察，非梗死區(qū)染為紅色，梗死區(qū)呈蒼白色，紅色區(qū)與蒼白色區(qū)之間為缺血區(qū)。拍照后，用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，計算分析梗死區(qū)的面積。

1.3.3 TUNEL染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡取心室肌組織，切成0.5 cm3的小塊，用4%多聚甲醛磷酸固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成厚度為10 μm的切片，用光鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。正常心肌細(xì)胞核染成藍(lán)色，凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色。每張切片隨機(jī)選擇5個視野，光鏡下放大200倍，記錄陽性染色的心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù)，按以下公式計算凋亡指數(shù)(AI)：AI=陽性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.4 Western印跡法檢測心肌組織Bcl-2與Bax的表達(dá)取大鼠心臟組織，提取組織蛋白質(zhì)，保存?zhèn)溆?。超微量分光光度計測蛋白質(zhì)濃度；取100 μl上清液(細(xì)胞裂解液)，取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液，并加等體積的電泳加樣緩沖液，沸水浴中3 min，上樣、電泳(濃縮膠20 mA，分離膠35 mA)，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100 mA 40 min)。膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色Western印跡ECL試劑盒顯色，在成像系統(tǒng)上成像記錄結(jié)果。以Bcl-2、Bax蛋白及β-actin的比值進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞AI的變化見表1。與IR組相比，IPC組的梗死面積及心肌細(xì)胞AI顯著降低(P<0.05)；與IPC組的梗死面積比較， 不同劑量當(dāng)歸預(yù)處理組的梗死面積及心肌細(xì)胞AI均顯著降低，且有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系 (P<0.05，或P<0.01)。

2.2 各組大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)見表2、圖1。與IR組相比，IPC組Bcl-2蛋白的表達(dá)增多，Bax的表達(dá)減少(P<0.05)。與IPC組比較， 不同劑量當(dāng)歸預(yù)處理組的Bcl-2蛋白的表達(dá)增多，Bax蛋白的表達(dá)減少，且有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，以DH-IPC組效應(yīng)最為顯著 (P<0.05，P<0.01)。

表1　各組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞 ± s, n=8)

與IR組比較 1)P<0.05；與IPC組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

表2　各組大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

圖1　各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3討論

當(dāng)歸有多種心血管藥理作用，臨床可用于缺血性心臟病的治療，實驗研究表明，當(dāng)歸注射液對大鼠IR損傷心肌細(xì)胞有重要的保護(hù)作用〔2〕。湯劑是臨床中藥應(yīng)用的主要形式，而劑量是影響中藥湯劑功效方向發(fā)揮的重要因素，在中國藥典中當(dāng)歸湯劑的用量規(guī)定為6～12 g〔3〕，臨床實踐表明當(dāng)歸小劑量應(yīng)用則補(bǔ)血，大劑量應(yīng)用則活血〔4〕。而“活血”是當(dāng)歸防治缺血性心肌疾病的主要中藥功效基礎(chǔ)。大劑量當(dāng)歸水煎液口服給藥防治缺血性心肌疾病則未見報道。

IPC對心肌具有強(qiáng)大的保護(hù)作用，但難以應(yīng)用于臨床，而藥理預(yù)適應(yīng)卻能彌補(bǔ)這一缺陷，藥理預(yù)適應(yīng)是根據(jù)IPC機(jī)制，通過藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)而呈現(xiàn)的保護(hù)心臟的作用。心肌缺血和再灌注過程中重要的病理變化就是心肌細(xì)胞死亡，其形式之一主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，而IPC可減少心肌細(xì)胞凋亡。研究證明心肌細(xì)胞凋亡在心肌IR中普遍存在，并起主導(dǎo)作用〔5〕。心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡基因的調(diào)控下進(jìn)行的，其中 Bcl-2、Bax 相關(guān)凋亡基因被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用〔6〕。Bax作為Bcl-2的同源體，與Bcl-2一樣在組織中廣泛表達(dá)，其作用是抑制Bcl-2表達(dá)及活性〔7〕。本研究證實心肌IR可使心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，IPC則可降低其梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡，對心肌損傷起到了一定的保護(hù)作用。而在IPC的基礎(chǔ)上，給予不同大劑量的當(dāng)歸水煎劑，均可進(jìn)一步降低心肌梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡，尤其以相當(dāng)于人劑量的120 g的大劑量當(dāng)歸水煎液最為顯著。其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1陳彥文，明海霞，王強(qiáng)，等．岷縣當(dāng)歸預(yù)適應(yīng)對大鼠缺血-再灌注心律失常的影響〔J〕．西部中醫(yī)藥，2013;18(2)：15-7．

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〔2013-12-06修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)