Bacillaene酮還原酶結(jié)構(gòu)域的異源表達(dá)及底物特異性分析

孫瀟慧，車程川，季俊杰，鄭艦艇，楊革

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Bacillaene酮還原酶結(jié)構(gòu)域的異源表達(dá)及底物特異性分析

孫瀟慧1,2*，車程川1*，季俊杰2，鄭艦艇2，楊革1

1 曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165 2 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

孫瀟慧, 車程川, 季俊杰, 等. Bacillaene酮還原酶結(jié)構(gòu)域的異源表達(dá)及底物特異性分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1355–1362.Sun XH, Che CC, Ji JJ, et al. Heterologous expression and substrate specificity of ketoreductase domain in Bacillaene polyketide synthase. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1355–1362.

Bacillaene生物合成過程中，聚酮合酶第一個(gè)延伸模塊的酮還原酶結(jié)構(gòu)域 (BacKR1) 既催化α酮基的還原，也催化β酮基的還原，具有天然的底物寬泛性。為進(jìn)一步研究該結(jié)構(gòu)域的底物特異性，在大腸桿菌中對(duì)其進(jìn)行了異源表達(dá)。體外酶學(xué)分析表明BacKR1可以催化聚酮類底物 (±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯外消旋體的立體選擇性還原，僅生成4種非對(duì)映異構(gòu)體中的一種，此外BacKR1還可以催化環(huán)己酮和對(duì)氯苯乙酮等非聚酮類底物的還原，暗示了聚酮合酶中酮還原酶結(jié)構(gòu)域作為生物催化劑的潛力。

聚酮，酮還原酶，異源表達(dá)，立體選擇性，底物特異性

聚酮類化合物是由微生物、植物等產(chǎn)生的一大類具有活性和結(jié)構(gòu)多樣性的天然產(chǎn)物。許多聚酮類化合物已經(jīng)被開發(fā)為抗癌、抗感染、抗病毒和抗寄生蟲等藥物，用于人類疾病的治療[1-2]。聚酮類天然產(chǎn)物的生物合成過程類似于脂肪酸的合成，由短鏈羧酸通過連續(xù)的脫羧聚合而形成。然而與脂肪酸合成機(jī)制一個(gè)明顯的區(qū)別是，在聚酮合酶 (Polyketide synthase，PKS) 模塊中常常有一個(gè)修飾結(jié)構(gòu)域酮還原酶 (Ketoreductase，KR)，從而在聚酮終產(chǎn)物中留下許多β-羥基手性中心。此外聚酮合成前體常常是丙酸，導(dǎo)致聚酮內(nèi)酯環(huán)上具有多個(gè)α-甲基手性中心[3]。聚酮的生物合成機(jī)制研究表明，KR結(jié)構(gòu)域同時(shí)控制產(chǎn)物中α碳和β碳的立體構(gòu)型，相應(yīng)地KR結(jié)構(gòu)域被分為A1、A2、B1、B2四種不同類型 (圖1A)[4]。KR結(jié)構(gòu)域可以在大腸桿菌中異源表達(dá)并且保留催化聚酮類底物還原的能力[5]。此外人們還發(fā)現(xiàn)，某些KR結(jié)構(gòu)域，如紅霉素聚酮合酶第一個(gè)延伸模塊中的EryKR1，可以催化非聚酮底物如環(huán)己酮、二辛酮的還原，表明KR結(jié)構(gòu)域具有作為生物催化劑的潛力[6-7]。

Bacillaene是枯草芽胞桿菌中由PKS和非核糖體肽合成酶 (Nonribosomal peptide-synthetase，NRPS) 共同催化合成的一種抗生素[8-9]。其PKS第一個(gè)延伸模塊中的KR結(jié)構(gòu)域 (BacKR1) 既可以催化β酮基的還原，也可以催化α酮基的還原 (圖1B)[10]。為研究其底物特異性，利用大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)。體外分析顯示BacKR1可以催化外消旋聚酮類底物 (±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯 ((±) 2-methyl-3-oxopentanoate N-acetyl cysteamine thioester，MOP-NAC) 的立體選擇性還原，只生成4種非對(duì)映異構(gòu)體中的一種，表明BacKR1可以作為生物催化劑合成手性純的α-甲基-β-羥基酯作為聚酮合成的前體。對(duì)8種非聚酮底物的還原表明BacKR1可以催化環(huán)己酮和對(duì)氯苯乙酮的還原，且與EryKR1相比具有不同的底物譜，暗示了聚酮合酶KR結(jié)構(gòu)域作為生物催化劑的潛力。

圖1 酮還原酶催化的酮基還原反應(yīng)[4,10]

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET28a、菌株BL21 (DE3)、JM109和枯草芽胞桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。LB培養(yǎng)基(成分 (1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g) 用于培養(yǎng)；BPY培養(yǎng)基(成分 (1 L)：牛肉提取物5 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g) 用于培養(yǎng)枯草芽胞桿菌。抗生素及誘導(dǎo)劑使用濃度：50 μg/mL硫酸卡那霉素 (Kana)，50 μg/mL氯霉素 (Cl)，0.1 mmol/L異丙基-b-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)。

KOD Plus DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司。T4 DNA連接酶和DNA限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB。Ni-NTA-Sepharose填料購(gòu)自北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司?；瘜W(xué)試劑NADP+和NADPH均購(gòu)自Sigma-Al-drich公司。環(huán)己酮、苯乙酮、苯丙酮、對(duì)氯苯乙酮、4-氟苯乙酮、2-辛酮、苯丙酮酸、乙酰乙酸乙酯購(gòu)自北京中科助研商貿(mào)有限公司。二聚酮底物類似物 (±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯由本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)合成[11]。PCR擴(kuò)增引物合成和DNA測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 BacKR1異源表達(dá)載體的構(gòu)建

為了便于蛋白純化，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-BacKR1。以枯草芽胞桿菌的基因組為模板，利用引物5′-ATCGTAATCGAACGC TTAATGCTTGAACCGGTGT-3′和5′-TGATTCG ATATCCTTGATCCTGATCCGCCTTTCTC-3′ (下劃線表示Ⅰ和RⅠ酶切位點(diǎn)) PCR得到含有完整BacKR1的基因片段。用Ⅰ和RⅠ酶切BacKR1片段和pET28a，將酶切得到的載體和目的片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109，對(duì)得到的克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)序，篩選得到構(gòu)建正確的pET28a-BacKR1。

1.2.2 BacKR1的蛋白表達(dá)與純化

將pET28a-BacKR1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)。挑取單克隆，在含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600為0.4–0.6，加入IPTG至0.1 mmol/L，16 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)16 h。離心收集菌體重并懸于50 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl緩沖液(pH 7.5)，超聲破碎后離心取上清。親和層析得到的蛋白進(jìn)一步用分子篩 (Superdex 200，GE) 進(jìn)行純化，得到純度>95%的蛋白。

1.2.3 外消旋MOP-NAC的合成與還原

化學(xué)合成：半胱胺鹽酸鹽 (1.0 mol)，氫氧化鉀 (1.5 mol) 和碳酸氫鈉 (3.0 mol) 溶于水中常溫下攪拌，然后分批滴加乙酸酐 (0.9 mol)，滴加時(shí)間超過5 min，常溫下反應(yīng)15 min處理得到無(wú)色透明油狀液體 (化合物1)。三乙胺 (0.8 mL) 溶于10 mL的二氯甲烷，然后分批加入丙酰氯 (0.5 mL)，加入時(shí)間超過15 min，常溫下反應(yīng)1 h處理得到黃色油狀液體 (化合物2)?；衔? (2.1 mol) 溶于二氯甲烷中，然后加入化合物1 (1.0 mol) 和幾滴三乙胺，混合物在常溫下反應(yīng)30 min處理得到外消旋的MOP-NAC (化合物3) (圖2)。

化學(xué)還原：MOP-NAC (1.0 mol) 溶于四氫呋喃中，加入硼氫化鈉 (2.0 mol) 后0 ℃下反應(yīng)4 h得到無(wú)色油狀液體 (化合物4) (圖2)?；衔?溶于80%正己烷和20%乙醇，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用OC-H手性柱 (250 mm×4.6 mm，大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司) 進(jìn)行分離，產(chǎn)物洗脫順序如圖4所示，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，流動(dòng)相為93%的正己烷和7%的乙醇，流速0.8 mL/min[11]。

1.2.4 外消旋MOP-NAC的酶法還原

將純化得到的酶加入到反應(yīng)體系中 (總體積為0.2 mL，含有20 μmol/L BacKR1，100mmol/LNADP+，50 mmol/L D-葡萄糖，5 μmol/L葡萄糖脫氫酶 (Glucose dehydrogenase，GDH)，50 mmol/L HEPES，10%甘油，100 mmol/L NaCl和1 mmol/L MOP-NAC)，30 ℃反應(yīng)過夜。

為確定立體構(gòu)型，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯萃取，真空抽干，殘留物用80%正己烷和20%乙醇溶解。采用上述條件，利用OC-H手性柱分離產(chǎn)物，并通過與化學(xué)還原的4種產(chǎn)物進(jìn)行比較，確定產(chǎn)物構(gòu)型[11]。

圖2 (±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯的合成路線及化學(xué)還原[11]

1.2.5 非天然底物的還原

利用NADPH在340 nm的吸收檢測(cè)BacKR1還原非天然底物的能力。反應(yīng)體系為25 μL，含20 μmol/L BacKR1，1 mmol/L NADPH，50 mmol/L HEPES，10%甘油，100 mmol/L NaCl和1 mmol/L底物，30 ℃反應(yīng)15 min，測(cè)定340的下降，以不加酶的反應(yīng)液作為對(duì)照。選用底物為環(huán)己酮、苯乙酮、苯丙酮、對(duì)氯苯乙酮、4-氟苯乙酮、2-辛酮、苯丙酮酸、乙酰乙酸乙酯。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)

PKS是分子量巨大 (常大于600 kDa) 的多結(jié)構(gòu)域、多模塊酶復(fù)合物，表達(dá)純化和酶學(xué)分析困難[12]。近十年來的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和體外功能分析表明，PKS可以被拆分成具有催化功能的結(jié)構(gòu)域，并且這些單獨(dú)表達(dá)的結(jié)構(gòu)域重組在一起后可以執(zhí)行完整模塊的功能，雖然催化效率會(huì)有所下降[13]。在此過程中，合理選擇結(jié)構(gòu)的邊界，保持其結(jié)構(gòu)上的完整性，是獲得有催化活性的結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵。BacKR1的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報(bào)道，根據(jù)該晶體結(jié)構(gòu)確定結(jié)構(gòu)域的邊界，利用材料方法中的引物PCR擴(kuò)增得到1 275 bp的片段，編碼425個(gè)氨基酸[14]。酶切和測(cè)序驗(yàn)證正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) 中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析及Superdex 200凝膠過濾得到純度＞95%的目的蛋白(圖3)。

2.2 外消旋聚酮類底物的還原

KR結(jié)構(gòu)域的天然底物通過磷酸泛酰巰基乙胺臂連接在?；d體蛋白 (Acyl carrier protein，ACP) 上，如圖1所示，化學(xué)合成非常困難。為研究BacKR1的立體特異性，我們化學(xué)合成了聚酮底物替代物MOP-NAC。這種α位有取代基的β酮酯類化合物的α氫具有較強(qiáng)的酸性，手性中心很容易發(fā)生消旋化。某些KR結(jié)構(gòu)域，可以特異性地選擇一種底物進(jìn)行不對(duì)稱還原，獲得4種非對(duì)映異構(gòu)體中的一種[5]。還原型輔因子NADPH價(jià)格昂貴，而氧化型的NADP+相對(duì)便宜，基于來源GDH的輔因子再生系統(tǒng)可以有效降低反應(yīng)成本[15-17]。前人的研究表明，利用上述方法可以大量制備手性純的α-甲基-β-羥基酯作為聚酮合成的前體[11]。但并非所有的KR結(jié)構(gòu)域都具有高度立體選擇性，只生成一種還原產(chǎn)物。目前可用的KR只有A1型的AmpKR2、A2型的AmpKR1、B1型的TylKR1以及B2型的EryKR1和PikKR1[11]。

為研究BacKR1的立體選擇性，利用大賽璐OC-H手性柱對(duì)其催化產(chǎn)物進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示主要產(chǎn)物是(2S,3S)-構(gòu)型，表明BacKR1是一種新的可用于酶法制備手性純?chǔ)?甲基-β-羥基酯聚酮合成前體的A2型KR結(jié)構(gòu)域 (圖4)。以α位沒有甲基取代基的3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯為底物的還原研究發(fā)現(xiàn)超過90%的還原產(chǎn)物為R構(gòu)型，說明α甲基對(duì)底物在BacKR1活性中心的結(jié)合有非常大的影響，導(dǎo)致底物以不同方式結(jié)合，從而把β酮基的不同面呈現(xiàn)給輔因子NADPH攻擊，生成取向相反的羥基[14]。

圖3 BacKR1的蛋白純化

圖4 BacKR1催化 (±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯的還原

2.3 非聚酮底物的還原

除催化聚酮類底物的還原外，KR結(jié)構(gòu)域還可以催化多種非聚酮底物的的還原[6-7]。在bacillaene合成過程中，BacKR1既可以還原β酮基，也可以還原α酮基，具有內(nèi)在的底物寬泛性[10]。為研究其還原非聚酮底物的能力，選取了苯丙酮、苯乙酮、對(duì)氯苯乙酮、對(duì)氟苯乙酮、苯丙酮酸、環(huán)己酮、2-辛酮以及乙酰乙酸乙酯等8種化合物作為底物 (圖5)。通過監(jiān)測(cè)NADPH的消耗發(fā)現(xiàn)BacKR1可以催化環(huán)已酮和對(duì)氯苯乙酮的還原 (表1)，而EryKR1則對(duì)環(huán)己酮、苯丙酮和乙酰乙酸乙酯表現(xiàn)出催化活性，表明二者具有不同的底物譜，各具優(yōu)勢(shì)[18]。

圖5 本研究中采用的非天然酮基化合物

表1 通過NADPH的消耗測(cè)定聚酮BacKR1的活性

aOne unit of activity is defined as the amount of BacKR1 required to produce 1 μmol product per minute. “ND”: no detectable.

3 討論

在聚酮類化合物生物合成過程中，KR結(jié)構(gòu)域決定絕大多數(shù)甲基和羥基手性中心的立體構(gòu)型[19]。通過KR結(jié)構(gòu)域的替換，已經(jīng)得到一些手性中心構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變的新聚酮[20]。晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了KR立體選擇性的分子機(jī)制，與產(chǎn)物手性中心構(gòu)型相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基也已經(jīng)被確定，通過這些殘基的突變可以改變KR的立體選擇性，例如僅僅通過催化中心兩個(gè)位點(diǎn)的突變可以把A1型KR轉(zhuǎn)變成A2型[21]。然而KR結(jié)構(gòu)域作為生物催化劑的潛力才剛剛被認(rèn)識(shí)到。

具有多個(gè)甲基和羥基手性中心導(dǎo)致聚酮類化合物的全合成非常困難。利用生物催化 (包括細(xì)胞和酶) 獲得手性純的α-甲基-β-羥基酯作為聚酮合成的前體，可以大大降低聚酮合成的難度[11]。外消旋的α-甲基-β-酮酯的合成 (例如MOP-NAC) 相對(duì)簡(jiǎn)單，并且能夠被KR結(jié)構(gòu)域還原。但是許多單獨(dú)表達(dá)的KR結(jié)構(gòu)域在底物選擇和酮基還原過程中的立體選擇性不高，例如EryKR2還原該底物時(shí)生成所有4種可能的非對(duì)映異構(gòu)體[5]。因此選擇一個(gè)好的KR結(jié)構(gòu)域，是α-甲基-β-羥基酯酶法制備過程中的關(guān)鍵。前人研究中，通過對(duì)11種不同來源KR結(jié)構(gòu)域的體外分析，確定了5種不同立體選擇性的KR可以用于手性純?chǔ)?甲基-β-羥基酯的大規(guī)模制備[11]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BacKR1可以將MOP-NAC立體選擇性地還原成(2S,3S)-構(gòu)型產(chǎn)物，為A2型KR結(jié)構(gòu)域在AmpKR1之外提供了另外一種選擇。近期在嗜熱菌中也發(fā)現(xiàn)了PKS，對(duì)其催化功能的研究有可能發(fā)現(xiàn)更穩(wěn)定、效率更高的KR結(jié)構(gòu)域。

手性醇作為可以引入手性中心的模塊，在藥物、精細(xì)化學(xué)品和農(nóng)用化學(xué)品的合成中有十分廣泛的應(yīng)用[22-23]。酮基化合物酶法不對(duì)稱還原合成手性醇因具有立體選擇性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)過程對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)越來越受到人們的重視[24-25]。目前，酵母是酮基還原酶的最重要來源[26]。然而前人的研究和本研究都顯示聚酮合酶中的KR結(jié)構(gòu)域可以催化多種酮基化合物的還原，并且不同來源的KR具有不同的底物譜[6-7,15]。由于聚酮化合物種類繁多，結(jié)構(gòu)多樣，不同來源KR所識(shí)別的底物結(jié)構(gòu)差別非常大，對(duì)聚酮合酶KR結(jié)構(gòu)域底物特異性的深入探索有可能發(fā)現(xiàn)具有應(yīng)用潛力的生物催化劑。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Heterologous expression and substrate specificity of ketoreductase domain in bacillaene polyketide synthase

Xiaohui Sun1,2*, Chengchuan Che1*, Junjie Ji2, Jianting Zheng2, and Ge Yang1

1 Collage of Life Sciences, Qufu Normal University, Qufu 273156, Shandong, China 2 State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

The ketoreductase (KR) domain in the first extending module of the polyketide synthase (PKS) catalyzes the reductions of both ana-keto group and ab-keto group in the biosynthesis of bacillaene, suggesting the intrinsic substrate promiscuity. In order to further investigate the substrate specificity, the KR domain (BacKR1) was heterologously overexpressed in.enzymatic analysis showed that only one of the four diastereomers was formed in the reduction of the racemic (±)-2-methyl-3-oxopentanoyl--acetylcysteamine thioester catalyzed by BacKR1. In addition, BacKR1 was revealed to catalyze the reductions of cyclohexanone and p-chloroacetophenone, indicating the potential of KR domians of PKSs as biocatalysts.

polyketide, ketoreductase, heterologous expression, stereoselectivity, substrate specificity

10.13345/j.cjb.140580

November 24, 2014; Accepted:April 28, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB734000), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31370101, 31400051), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 5144031), the Recruitment Program of Global Youth Expertsand Initial Funds of Chinese Academy of Sciences.

Ge Yang. Tel: +86-537-4456179, E-mail:yangge100@126.com Jianting Zheng. Tel: +86-10-82545065, E-mail: jtzheng@ipe.ac.cn

*These authors contributed equally to this study.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB734000)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31370101，31400051)，北京市自然科學(xué)基金 (No. 5144031)，青年千人計(jì)劃和中國(guó)科學(xué)院?jiǎn)?dòng)資金資助。

2015-06-08

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150608.1510.007.html