18S rDNA介導(dǎo)的FKS1基因過(guò)表達(dá)對(duì)酵母自溶性能的影響

李佳，王金晶，李崎

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18S rDNA介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)對(duì)酵母自溶性能的影響

李佳1,2，王金晶1,2，李崎1,2

1 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無(wú)錫 214122

李佳, 王金晶, 李崎. 18S rDNA介導(dǎo)的FKS1基因過(guò)表達(dá)對(duì)酵母自溶性能的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1344–1354.Li J, Wang JJ, Li Q. Overexpression of FKS1 by 18S rDNA targeted influence on yeast autolysis. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1344–1354.

酵母被譽(yù)為啤酒釀造的靈魂，然而隨著啤酒高濃釀造技術(shù)的發(fā)展，釀造過(guò)程中滲透壓增加、乙醇含量升高及營(yíng)養(yǎng)平衡改變等會(huì)加快酵母的自溶，對(duì)啤酒的風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。為提高酵母的抗自溶能力，本研究構(gòu)建了以釀酒酵母18S rDNA序列為同源位點(diǎn)的過(guò)表達(dá)菌株。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)菌株細(xì)胞壁葡聚糖含量較原菌高62%；通過(guò)平板耐受性分析可知，過(guò)表達(dá)菌株在8%的乙醇濃度、0.4 mol/L NaCl的滲透壓沖擊以及24 h饑餓培養(yǎng)的條件下，其脅迫耐受性均高于原始菌株；模擬自溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)菌株自溶速度緩慢，抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株。該結(jié)果有助于探究酵母自溶的機(jī)理，同時(shí)也對(duì)提高啤酒風(fēng)味品質(zhì)和穩(wěn)定性有著重要的意義。

釀酒酵母，細(xì)胞壁，β-1,3-葡聚糖，抗環(huán)境脅迫，模擬自溶

釀酒酵母是與人類關(guān)系最為廣泛和密切的一種微生物，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于釀酒和制作面包、饅頭；在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中也常被用作模式生物，是研究真核細(xì)胞遺傳學(xué)和生理學(xué)的重要工具[1]。因此可謂是工業(yè)界最為重要的微生物之一。

在啤酒發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵過(guò)程的深入進(jìn)行，酵母所處環(huán)境的滲透壓、乙醇濃度不斷升高，營(yíng)養(yǎng)成分不斷減少[2]，這種變化促使酵母衰老，胞內(nèi)的生物化學(xué)過(guò)程受到破壞，各種酶和底物的作用失去協(xié)調(diào)性，致使酵母開(kāi)始自 溶[3]。自溶過(guò)程會(huì)促使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外，帶給啤酒酵母味、加重的澀味、苦味等風(fēng)味上的改變，同時(shí)使酒體的泡持性及風(fēng)味穩(wěn)定性變差，極大地影響了啤酒的品質(zhì)[4]。

酵母細(xì)胞壁是抵抗外界環(huán)境刺激的一個(gè)非常重要的屏障[5-6]，其堅(jiān)固程度直接影響著酵母衰老死亡的速度。研究表明，葡聚糖作為酵母細(xì)胞壁的重要組成成分，對(duì)維持酵母細(xì)胞形態(tài)、增加細(xì)胞壁堅(jiān)韌性、抵抗外界環(huán)境刺激等方面發(fā)揮著重要的作用[7]。在釀酒酵母的基因組中，基因直接調(diào)控細(xì)胞壁葡聚糖合成酶的表 達(dá)[8-10]。因此，可以通過(guò)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞壁，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞的自溶。

在酵母基因的過(guò)表達(dá)過(guò)程中，使用最為廣泛的載體分別是附加型載體 (YEP) 和整合型載體 (YIP)[11]。其中YEP型載體具有獨(dú)立存活及拷貝數(shù)較高的優(yōu)點(diǎn)，不足之處在于質(zhì)粒容易丟失，即穩(wěn)定性較差；相比之下，YIP型載體當(dāng)整合入酵母基因組后則特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但存在拷貝數(shù)低的問(wèn)題[11]。所以，拷貝數(shù)高、穩(wěn)定性強(qiáng)的基因過(guò)表達(dá)方式將會(huì)得到很好的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母的XII染色體中存在100?140個(gè)拷貝的rDNA[12-15]，并且rDNA的序列有高度的保守性。因此，將此rDNA序列作為同源重組的整合位點(diǎn)可以使目的基因得到高效且穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)，本文即在此理論基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將其整合到釀酒酵母中達(dá)到過(guò)表達(dá)基因的目的。

綜上所述，本研究通過(guò)選取18S rDNA為同源重組整合位點(diǎn)，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)釀酒酵母基因的重組菌。結(jié)果表明，和野生菌相比，重組菌的細(xì)胞壁葡聚糖含量增多，從而使得其抗自溶能力有了很大的提高。對(duì)探究酵母自溶機(jī)理、提高啤酒風(fēng)味品質(zhì)及穩(wěn)定性方面發(fā)揮了積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素至100 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。制備平板時(shí)添加20 g瓊脂，用于酵母培養(yǎng)。篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)需添加G418至200 μg/mL。固體平板抗性實(shí)驗(yàn)時(shí)需添加無(wú)水乙醇至8%濃度，NaCl至0.4 mol/L濃度。

DNA聚合酶、DNA聚合酶、Prime STAR Max及克隆載體pMD19T-simple、T4 DNA連接酶、感受態(tài)細(xì)胞制作試劑盒、限制性內(nèi)切酶HⅠ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ均購(gòu)自TaKaRa公司；酵母基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、柱式膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司。其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建

以W303酵母基因組為模板，擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，得到Ⅰ--ⅡHⅠ片段；將得到的片段與T載體連接構(gòu)建pTP質(zhì)粒。再以W303酵母基因組為模板，擴(kuò)增基因序列，得到Ⅱ-HⅠ片段；最后通過(guò)Ⅱ與HⅠ雙酶切pTP質(zhì)粒及片段，連接構(gòu)建pTPF質(zhì)粒。

以pUG6質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增基因片段，得到ⅠHⅠⅠⅠ片段；將得到的該片段與T載體連接構(gòu)建pTK1質(zhì)粒。再以W303酵母基因組為模板，擴(kuò)增18S rDNA下臂，即Ⅰ18S rDNAdownⅠ片段；通過(guò)Ⅰ與Ⅰ雙酶切連接pTK1質(zhì)粒及下臂片段，構(gòu)建pTK2質(zhì)粒。最后以W303酵母基因組為模板，擴(kuò)增18S rDNA上臂，即Ⅰ18S rDNAupⅠHⅠ片段；通過(guò)Ⅰ與HⅠ雙酶切pTK2質(zhì)粒與上臂片段，構(gòu)建pTK重組質(zhì)粒。

pTPF及pTK重組質(zhì)粒通過(guò)Ⅰ與HⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建pTPFK質(zhì)粒。再通過(guò)Ⅰ與Ⅰ雙酶切獲得目的同源整合線性片段：up-down。將所獲片段按照醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[12]轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后先涂布到Y(jié)PD平板上，24 h后影印[16]到含200 μg/mL G418的平板上，28 ℃培養(yǎng)2?4 d，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子。片段擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證所需引物及條件如表2所示：

表2 實(shí)驗(yàn)所需引物及擴(kuò)增條件

1.2.2 生長(zhǎng)性能分析

將釀酒酵母野生對(duì)照菌株W303、重組菌W303-KT斜面菌種進(jìn)行活化，接入裝有10 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，然后以10%的接種量接入裝有30 mL YPD培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)。先每隔2 h取樣，30 h后逐漸延長(zhǎng)取樣間隔時(shí)間，測(cè)定600值并作酵母生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)分析

將釀酒酵母野生對(duì)照菌株W303、重組菌W303-KT斜面菌種進(jìn)行活化，接入裝有10 mL 麥汁培養(yǎng)基的試管中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h；然后1 500 r/min離心10 min收集菌體進(jìn)行掃描電鏡制樣、鏡檢。

1.2.4 葡聚糖含量分析

樣品處理：首先配制1.0 mol/L氫氧化鈉溶液100 mL，取離心收集的酵母泥5 g加入其中，在90 ℃條件下反應(yīng)3 h，后3 000 r/min離心 15 min，沉淀物水洗2次，無(wú)水乙醇洗滌定容[17]。

分光光度計(jì)檢測(cè)：0.1 mL樣品 + 1.9 mL蒸餾水 + 4.0 mL剛果紅，20 ℃精確保溫10 min后于550 nm下測(cè)吸光值。以2.0 mL蒸餾水 + 4.0 mL剛果紅作空白。

β-葡聚糖含量 (mg/L) =××1/×20

式中，為試樣吸光值；為標(biāo)準(zhǔn)曲線上吸光度為1時(shí)對(duì)應(yīng)的β-葡聚糖μg數(shù)；為吸取稀釋試樣體積的毫升數(shù)；20為試樣稀釋倍數(shù)。

1.2.5 環(huán)境耐受性分析

于斜面試管中取一環(huán)菌接入5 mL YPD液體培養(yǎng)基中(饑餓培養(yǎng)則接入相同體積的無(wú)菌水中)，28 ℃培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌液濃度使其=1.0，10倍稀釋梯度，依次取2.5 μL點(diǎn)種在含有8%乙醇、0.4 mol/L NaCl的抗性平板上，以及將饑餓培養(yǎng)的按照同樣方法點(diǎn)種在YPD平板上，培養(yǎng)2–3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況[18]。

1.2.6 模擬自溶分析

參考王敏等[19]的方法培養(yǎng)和收集酵母，2 g酵母泥加到200 mL的檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.0)(模擬自溶液) 中，于28 ℃、150 r/min放置，定時(shí)取樣測(cè)定。

酵母細(xì)胞死亡率的測(cè)定及260和280的測(cè)定及比值計(jì)算方法參照許維娜等[20]方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建與篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照1.2.1質(zhì)粒的構(gòu)建方法，依次構(gòu)建pTPF和pTK重組質(zhì)粒(圖1和圖2)；通過(guò)Ⅰ與Ⅰ雙酶切連接上述兩個(gè)質(zhì)粒，構(gòu)建pTPFK質(zhì)粒，通過(guò)Ⅰ與Ⅰ、Ⅰ與HⅠ雙酶切分別來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子(圖3和圖4)。

2.1.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及驗(yàn)證

用醋酸鋰法將所得的目的片段轉(zhuǎn)化入野生對(duì)照菌W303，使重組片段兩端的同源臂與目的基因18S rDNA發(fā)生同源重組，即用up--down來(lái)替換up-18S rDNA-down。然后通過(guò)平板影印法來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的基因組，使用不同位置的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示：A設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增18S rDNA-up和間的核苷酸序列，陽(yáng)性結(jié)果為1 270 bp；B設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增和18S rDNA-down間核苷酸片段，陽(yáng)性結(jié)果為975 bp。最終成功篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并命名為W303-KT。

圖1 pTPF質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

2.2 重組菌的基礎(chǔ)性能分析

2.2.1 重組菌基因的表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 來(lái)分析過(guò)表達(dá)菌株基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明重組菌株基因的表達(dá)量約為原菌的10倍(圖6)；同時(shí)，為驗(yàn)證轉(zhuǎn)化菌的遺傳穩(wěn)定性，將原菌和重組菌在無(wú)G418選擇壓力的條件下，連續(xù)轉(zhuǎn)接液體YPD 培養(yǎng)10次并用第10代菌液劃線。結(jié)果如圖7所示：重組菌可以在含有200 μg/mL G418的YPD平板上生長(zhǎng)，而原菌則不能，表明轉(zhuǎn)化菌的遺傳穩(wěn)定性良好。以上結(jié)果表明基于18S rDNA的過(guò)表達(dá)拷貝數(shù)高且穩(wěn)定性好。

圖2 pTK質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖3 pTPFK質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖4 pTPFK質(zhì)粒及酶切電泳圖

圖5 W303-KT轉(zhuǎn)化子基因組驗(yàn)證結(jié)果

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)性能

為分析重組菌與原菌的性狀異同點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)觀察，掃描電鏡結(jié)果顯示(圖8)：從外形上看，轉(zhuǎn)化菌與原菌并無(wú)大的差別。然而，生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果則顯示轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)速度始終快于原菌(圖9)。由此推測(cè)，基因的過(guò)表達(dá)加快了細(xì)胞壁葡聚糖的合成，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖6 原菌與重組菌的qRT-PCR分析

A B

2.3 重組菌自溶性能分析

為驗(yàn)證重組菌抗自溶能力的增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)首先分析了菌株的葡聚糖含量變化情況，然后通過(guò)模擬自溶實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)菌株的自溶性能，最后通過(guò)環(huán)境脅迫性分析給予輔證。

圖8 原菌與轉(zhuǎn)化菌的掃描電鏡 (SEM) 分析

圖9 不同菌株的生長(zhǎng)曲線

2.3.1 葡聚糖含量分析

葡聚糖含量檢測(cè)結(jié)果顯示原菌為 (3.50 ± 0.02)mg/g，重組菌為 (5.68 ± 0.03) mg/g，較原菌增長(zhǎng)62%。基因?yàn)檎{(diào)控β-1,3-葡聚糖合成酶的關(guān)鍵基因，由于基因的高效過(guò)表達(dá)，使得細(xì)胞壁內(nèi)葡聚糖含量增多。同時(shí)，重組菌細(xì)胞壁葡聚糖含量的變化為后面的自溶性能分析提供了理論比較依據(jù)。

2.3.2 模擬自溶

本研究采用模擬分析，將不同菌株置于模擬自溶液中進(jìn)行模擬自溶，以此來(lái)觀察菌株的生長(zhǎng)變化情況。首先，觀察了酵母細(xì)胞在模擬自溶液中的死亡率變化情況，結(jié)果如表3所示：重組菌株的死亡率明顯慢于原始菌株；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)模擬自溶液過(guò)濾后的濾液在260 nm和280 nm處的吸光度值進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算260/280，結(jié)果如表4所示。自溶開(kāi)始時(shí)，酵母釋放出的蛋白類物質(zhì)比例較大，260/280的值較小；隨著自溶程度的增大，自溶液中的核酸類物質(zhì)所占比例越來(lái)越大，260/A80的值也逐漸增大，向2.0靠近[20]。

基于本實(shí)驗(yàn)室先前的研究，我們對(duì)260/280與酵母的死亡率進(jìn)行擬合與分析，發(fā)現(xiàn)隨著酵母自溶程度的變化，(260/280)/死亡率呈現(xiàn)明顯且一致的變化趨勢(shì)，且酵母自溶程度越大該比值越小。該方法可適用于比較不同菌株的自溶性能，已得到良好的驗(yàn)證和應(yīng)用[20-21]。在此理論基礎(chǔ)上，W303-KT菌株的抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株 (數(shù)據(jù)未顯示)。

表3 酵母在自溶液中死亡率的變化

The results are presented as the average for three times.

表4 酵母在自溶液中A260/A280比值的變化

The results are presented as the average for three times.

2.3.3 環(huán)境脅迫性分析

基因是調(diào)控細(xì)胞壁完整性途徑中的重要基因之一，該基因的過(guò)表達(dá)可提高菌株的抗環(huán)境脅迫能力，即抵抗外界刺激的能力，是菌株抗自溶能力增強(qiáng)的重要輔證。結(jié)果表明，在分別含有8%的乙醇、0.4 mol/L NaCl以及饑餓培養(yǎng)的條件下，W303-KT菌株的生長(zhǎng)狀況均優(yōu)于原菌 (圖10)。該結(jié)果證明重組菌株具有更強(qiáng)的抵抗環(huán)境刺激的能力，從側(cè)面證明了菌株抗自溶能力的增強(qiáng)。

圖10 不同脅迫條件下菌株生長(zhǎng)狀況

3 結(jié)論

酵母是啤酒釀造的靈魂，強(qiáng)壯的酵母可以釀造出品質(zhì)優(yōu)良、風(fēng)味穩(wěn)定性好、無(wú)雜異味的啤酒。而酵母自溶是影響啤酒風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，自溶過(guò)程中會(huì)釋放出對(duì)啤酒質(zhì)量有較大負(fù)面影響的物質(zhì)，使啤酒帶有酵母味，加重苦味、澀味，使啤酒的泡持性及穩(wěn)定性變差，如果有5%的酵母發(fā)生自溶，將對(duì)啤酒質(zhì)量造成難以挽回的影響[22-23]。針對(duì)酵母自溶的研究，國(guó)內(nèi)學(xué)者多從實(shí)際生產(chǎn)和工藝角度出發(fā)，方法簡(jiǎn)單快捷，但通常不是十分有效[24-25]，并且不能從根本上理解和解決自溶問(wèn)題；而國(guó)外學(xué)者采用的方法因設(shè)備或技術(shù)限制，在國(guó)內(nèi)推廣的空間不大。因此需要探索酵母自溶的機(jī)理，尋求簡(jiǎn)單靈敏的方法來(lái)從根本上解決酵母自溶的問(wèn)題。

本研究從細(xì)胞壁的主要成分葡聚糖角度出發(fā)，運(yùn)用分子生物學(xué)手段過(guò)表達(dá)葡聚糖合成酶基因，獲得重組菌株W303-KT。研究表明，重組菌株細(xì)胞壁中葡聚糖積累量顯著增加，不但增強(qiáng)了酵母菌株對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗能力，更重要的是，通過(guò)模擬自溶實(shí)驗(yàn)證明，過(guò)表達(dá)菌株的抗自溶能力明顯優(yōu)于原始菌株，該發(fā)現(xiàn)對(duì)于進(jìn)一步研究酵母自溶的機(jī)理以及細(xì)胞壁完整性途徑(CWI) 的調(diào)控模式和調(diào)控因子功能奠定了基礎(chǔ)，有助于從根本上理解酵母自溶并加以控制和利用，為最終工業(yè)生產(chǎn)風(fēng)味品質(zhì)更優(yōu)、穩(wěn)定性更好的啤酒提供了理論依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Overexpression ofto improve yeast autolysis-stress

Jia Li1,2, Jinjing Wang1,2, and Qi Li1,2

1,,,214122,,2,,214122,,

With the development of high gravity brewing, yeast cells are exposed to multiple brewing-associated stresses, such as increased osmotic pressure, enhanced alcohol concentration and nutritional imbalance. These will speed up yeast autolysis, which seriously influence beer flavor and quality. To increase yeast anti-autolytic ability,overexpression strain was constructed by 18S rDNA. The concentration of β-1,3-glucan of overexpression strain was 62% higher than that of wild type strain. Meantime,overexpression strain increased anti-stress ability at 8% ethanol, 0.4mol/L NaCl and starvation stress. Under simulated autolysis,showed good anti-autolytic ability by slower autolysis. These results confirms the potential ofoverexpression to tackle yeast autolysis in high-gravity brewing.

, cell wall, β-1,3-glucan, anti-stress, the simulation of autolysis

10.13345/j.cjb.140629

December 20, 2014; Accepted: January 22, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31301539, 31271919).

Qi Li. Tel: +86-0510-86918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31301539, 31271919) 資助。

2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1114.002.html