轉(zhuǎn)人工miRNA抗玉米粗縮病毒載體玉米的培育及其抗病能力

宣寧，趙傳志，彭振英，陳高，邊斐，廉明政，劉國霞，王興軍，畢玉平,2

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轉(zhuǎn)人工miRNA抗玉米粗縮病毒載體玉米的培育及其抗病能力

宣寧1，趙傳志1，彭振英1，陳高1，邊斐1，廉明政1，劉國霞1，王興軍1，畢玉平1,2

1 山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100 2 山東省農(nóng)業(yè)科學院研究生教育中心，山東 濟南 250100

宣寧, 趙傳志, 彭振英, 等. 轉(zhuǎn)人工miRNA抗玉米粗縮病毒載體玉米的培育及其抗病能力. 生物工程學報, 2015, 31(9): 1375–1386.Xuan N, Zhao CZ, Peng ZY, et al.Development of transgenic maize with anti-rough dwarf virus artificial miRNA vector and their disease resistance. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1375–1386.

玉米是重要的糧食作物，水稻黑條矮縮病毒 (RBSDV) 是玉米粗縮病的病原，由其引起的玉米粗縮病給玉米生產(chǎn)造成重大損失。利用人工miRNA構建抗病毒植物的技術已經(jīng)在多種植物中被證明有效，但是在玉米中的嘗試未見報道。實驗根據(jù)玉米zea-miR159a的前體序列和RBSDV基因組中編碼功能蛋白的基因和基因沉默抑制子的序列信息設計引物，構建了用于沉默RBSDV編碼基因和基因沉默抑制子的amiRNA (Artificial miRNA) 基因。構建pCAMBIA3301-121-amiRNA植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31 (Z31)。對轉(zhuǎn)基因玉米進行分子檢測，選擇miRNA表達量高的純合體株系進行自然發(fā)病實驗，按0?4的分級標準調(diào)查玉米粗縮病的嚴重度。結果表明，轉(zhuǎn)抗粗縮病毒人工miRNA載體玉米純合體株系的抗病表現(xiàn)好于野生型玉米，其中針對基因組6的S6-miR159轉(zhuǎn)基因玉米抗病情況較好。研究表明利用人工miRNA技術構建抗病毒病玉米新品種是可行的。

amiRNA，玉米粗縮病毒，轉(zhuǎn)基因玉米

玉米是重要的糧食作物，是食品和飼料加工的重要原料。玉米病毒病害的發(fā)生和流行嚴重危害玉米生產(chǎn)，特別是玉米粗縮病，給玉米生產(chǎn)造成了很大的損失。

玉米粗縮病是由玉米粗縮病毒 (Maize rough dwarf virus，MRDV) 引起的，于1954年傳入我國[1]。研究證實，MRDV與引起水稻黑條矮縮病的病原-水稻黑條矮縮病毒 (Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV) 是同一種病毒[2-4]，該病毒除了侵染玉米和水稻，還能夠侵染高粱、大麥、小麥等其他禾本科糧食作物和雜草。RBSDV基因組由10條雙鏈RNA組成，按其在聚丙烯酰胺上遷移距離由小到大的順序依次命名為：S1–S10[5]。其中，RBSDV的S1–S6分別編碼病毒的一個重要蛋白，其中S1可能編碼RNA依賴的RNA聚合酶；S2長約3 813 nt，編碼一個有1 226個氨基酸組成的蛋白，推測可能是核心結構蛋白；S6長2 645 nt，雖然功能未知，但利用計算機軟件對其二級結構的預測和數(shù)據(jù)庫比較分析表明，其編碼蛋白存在高度保守的親水性結構域及多個跨膜區(qū)域，可能具有結合RNA及ATPase活性，表明RBSDV的S6基因可能具有編碼植物基因沉默抑制子的功能；S8全序列約為1 936 bp，只含有1個ORF，編碼蛋白的分子量約為68 kDa，可能是病毒的核心衣殼蛋白[6-7]。

MicroRNA (miRNA) 是真核生物中廣泛存在的一類具有調(diào)節(jié)功能的小分子RNA，這些小RNA能夠識別特定的靶mRNA，通過降解或抑制翻譯負調(diào)控靶基因的表達。人工miRNA (Artifical miRNA，amiRNA) 技術是利用內(nèi)源miRNA前體骨架 (Pre-miRNA)，通過替換pre-miRNA序列中的成熟片段 (miRNA/miRNA*)，產(chǎn)生具有新功能的miRNA[8]。利用MicroRNA的方法構建抗病毒植物已經(jīng)被證明是有效的，其在抗病育種方面的潛力逐漸被人們認識。Schwab等利用擬南芥pre-miRNA172和pre-miRNA319作骨架，將miRNA/miRNA*區(qū)替換成與目標mRNA互補的片段，形成了amiRNA，在擬南芥中超表達后引起表型的明顯改變[9]，證明amiRNA可以有效沉默單個和多個靶基因；Warthmann等利用水稻osa-MIR528作骨架構建了人工miRNA，成功對水稻靶基因高效干涉[10]。Niu等通過修飾擬南芥miR159的前體獲得了能夠分別針對P69和HC-Pro的amiR- P69159和amiR-HC-Pro159，表達amiR-P69159和amiR-HC-Pro159的轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠分別特異抵抗TYMV和TuMV病毒感染[11]。Qu等設計了針對黃瓜花葉病毒 (CMV) 的沉默抑制子2b的amiRNA并在煙草中表達，獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并且轉(zhuǎn)基因煙草的抗性水平和miRNA的表達水平成正相關[12]。這些結果均表明amiRNA 技術在植物中是可以廣泛應用的。

本文基于玉米粗縮病病毒序列，選擇其關鍵蛋白和基因沉默抑制子的保守序列構建amiRNA載體，轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系，分析轉(zhuǎn)基因植物后代的amiRNA表達水平及自然發(fā)病情況，推測利用amiRNA構建抗病毒病玉米新品種的可行性。

1 材料與方法

1.1 amiRNA載體的構建

選擇在玉米里表達量較高的miR159的pre-miRNA作為骨架，在WMD3 (Web MicroRNA Designer，http://wmd31weigelworld1org/cgi2bin/ webapp1cgi) 系統(tǒng)中設計amiRNA的成熟體序列 (表1)。使用WMD3的“Designer”工具，首先輸入RBSDV的基因組序列，找出能夠沉默RBSDV的候選amiRNA成熟體序列，再選擇玉米的基因組數(shù)據(jù)庫，輸入候選amiRNA成熟體序列，在線提交，通過和玉米基因組數(shù)據(jù)庫比對，確保amiRNA成熟體不會沉默玉米的內(nèi)源基因，并根據(jù)amiRNA 的相關參數(shù)(如m值等) 選擇amiRNA。設計正反向PCR引物并在引物端分別添加Ⅰ和HⅠ酶切位點 (表2)，通過PCR，得到帶有酶切位點的特異miRNA序列，通過酶切連接裝載到植物表達載體pCAMBIA3301-121上，成為amiRNA表達載體。

1.2 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化

將構建好的amiRNA表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105。在玉米自交系Z31自交授粉10?12 d后，剝?nèi)∮衩子着?，以農(nóng)桿菌介導的方法進行轉(zhuǎn)化。23 ℃共培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)入28 ℃培養(yǎng)室恢復培養(yǎng)?；謴团囵B(yǎng)后，第1輪采用5 mg/L終濃度的除草劑PPT進行篩選，以后3輪以終濃度為10 mg/L的PPT進行篩選。每2周為1輪篩選，前后共篩選4輪。將篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導胚狀體的培養(yǎng)基上進行誘導，3周后可以出現(xiàn)胚狀體。再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化，培養(yǎng)條件為28 ℃，每日3 000 Lx光強，光照16 h，很快就會有再生小苗出現(xiàn)。再生的小植株長到3片葉時，可將幼苗移植到玻璃瓶中，并在室內(nèi)培養(yǎng)。待小苗長出新葉及根后，將幼苗從玻璃瓶中取出，自來水沖凈培養(yǎng)基，移栽于混有營養(yǎng)土和蛭石 (1∶3) 的小花盆中。當玉米又長出2?3片新葉時，可將其移入溫室中進行正常生長。

表1 AmiRNA載體功能序列

Sense sequences were expressed in italics underlined, antisense sequences were expressed in italics underlined double.

表2 AmiRNA引物序列

The sequences in underlined means restriction enzyme sites.

1.3 PCR檢測

幼苗取葉片用CTAB提取法提取DNA，miRNA載體質(zhì)粒和野生型玉米分別作為陽性和陰性對照用Bar primer (表3) 進行PCR擴增鑒定。PCR檢測結果在1%瓊脂糖凝膠上觀察。

表3 引物序列

1.4 Basta涂抹檢測

將Basta原藥 (Phosphinothricin，PPT含量18%) 稀釋為3‰溶液。用毛筆涂抹或噴灑在玉米葉片上，2?3 d后觀察，出現(xiàn)黃褐色枯斑的植株表示對Basta敏感，仍保持原來綠色的為抗性株。

1.5 Real-time PCR檢測

純合體的苗子取樣按照Trizol試劑 (Invitrogen，USA) 說明書的方法提取總RNA?？俁NA (5 μg) 用RQI DNA酶 (Promega) 處理去除DNA殘留。第一鏈cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega) 合成。實時定量熒光PCR (RT-qPCR) 使用ABI 7300棱鏡HT序列檢測系統(tǒng) (Applied biosystems) 進行實驗。玉米α-Tubulin基因 (檢索號AY103544.2) 作為內(nèi)參 (Tubulin primer，表3) 來標準化模板cDNA。根據(jù)玉米內(nèi)源miRNA159的莖環(huán)序列設計引物 (miRNA159 primer，表3)。每個PCR重復3次。PCR體系為20 μL，含有1×SYBR綠色熒光染料混合物 (TaKaRa)、200 nmol/L引物、1 μL 1∶10稀釋的模板cDNA。PCR程序如下：預變性95 ℃ 5 min，40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 31 s，熔解曲線95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。實驗數(shù)據(jù)由ABI7300軟件 (Applied biosystems) 分析。miRNA相對表達量用2-△△Ct方法[13]計算，野生型玉米中表達量作為1，誤差線表示(=3)。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定

每個amiRNA載體選擇4個獨立的amiRNA 表達量高的轉(zhuǎn)基因玉米T2代純合體株系進行粗縮病毒自然發(fā)病實驗。每個單獨的株系種植100株。實驗在山東濟南飲馬泉實驗基地邊緣土地進行，轉(zhuǎn)基因玉米田間種植在轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)進行，周圍密集種植6行野生型玉米作為保護行。該試驗地一年兩熟，夏玉米和冬小麥輪作，試驗田周圍雜草叢生，保證了越冬和越夏的毒源。播期在5月中旬。株行距30 cm×60 cm。轉(zhuǎn)基因玉米與野生型玉米隔行種植。田間水肥、中耕管理和病蟲害防治同大田。玉米生長后期，按0?4級的如下分級標準[14]調(diào)查玉米粗縮病的嚴重度，掛牌標記調(diào)查株的病級。

玉米粗縮病嚴重度分級標準：0級：健株；1級：株高為健株株高的4/5左右，僅上部幾個葉片葉背面有白色蠟淚狀突起；2級：株高為健株株高的2/3左右，整株顯癥；3級：株高為健株株高的1/2左右，整株顯癥；4級：株高為健株株高的1/3以下，整株顯癥或提早枯死。

2 結果與分析

2.1 玉米粗縮病毒序列收集和關鍵基因鑒定

2010年收集山東省濟南、濟寧和德州的玉米粗縮病植株，提取病毒RNA，利用隨機引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI中公布的RBSDV基因組的序列設計引物，擴增獲得了這些地區(qū)RBSDV的S1、S2、S6和S8基因的序列，測序結果確認了引起這些地區(qū)玉米粗縮病的病原菌為RBSDV。將S1、S2、S6和S8的序列信息提交到在線軟件WMD3，設計了能夠沉默S1、S2、S6和S8基因的amiRNA成熟體序列及其星號序列。

根據(jù)玉米zea-miR159a的前體序列，我們設計了包含amiRNA成熟體序列的正向引物和包含人工miRNA成熟體星號序列的反向引物。通過PCR擴增獲得了amiRNA前體序列。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與PCR檢測

將amiRNA前體序列構建到植物表達載體中，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，通過農(nóng)桿菌介導方法轉(zhuǎn)入玉米幼胚，經(jīng)過共培養(yǎng)-恢復-4輪篩選-恢復-誘導-分化-生根-成苗等階段后得到玉米擬轉(zhuǎn)化株 (圖1)。

T0代幼苗取葉片提DNA進行PCR檢測，提取DNA后，通過Bar基因擴增確定是否有目的基因的插入。陽性植株是能擴增出與篩選基因Bar同樣大小的條帶 (370 bp)，而未轉(zhuǎn)化植株沒有擴增出相應的片段。部分植株的PCR結果如圖2所示。

每個載體我們轉(zhuǎn)化了大約3 000?5 000個玉米幼胚，經(jīng)過4 輪篩選S1收到了11個轉(zhuǎn)基因株系，S2收到了10個轉(zhuǎn)基因株系，S6收到了26個轉(zhuǎn)基因株系，S8收到了15個轉(zhuǎn)基因株系。

2.3 Basta涂抹檢測

T1代轉(zhuǎn)基因玉米長至5?7葉期時進行Basta涂抹檢測，選擇Basta抗性株與非抗性株 (圖3)3∶1分離的株系繁殖T2代種子。

T2代轉(zhuǎn)基因玉米長至5?7葉期時同樣進行Basta涂抹檢測，若同一株系的苗子全部對Basta有抗性，即保持原來綠色的即為純合株系。選擇純合株系進行后續(xù)的分子檢測和表型鑒定。

圖1 農(nóng)桿菌介導的玉米轉(zhuǎn)化

圖2 T0代轉(zhuǎn)基因苗PCR分子檢測

圖3 涂抹Basta表型示意圖

2.4 轉(zhuǎn)基因植株amiRNA表達量檢測結果

Basta篩選鑒定純合體的苗子混合取樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由于miRNA前體的表達模式與成熟miRNA的表達模式一致[20]，根據(jù)構建載體使用的玉米內(nèi)源miRNA159的莖環(huán)序列設計引物，用Real-time PCR的方法鑒定pre-miRNA表達量，借此反映成熟miRNA的表達量，結果表明轉(zhuǎn)基因玉米中外源amiRNA有所表達，但表達程度不一致 (圖4)。部分轉(zhuǎn)基因玉米amiRNA表達量下降，可能由于轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象所致。

2.5 轉(zhuǎn)miRNA載體玉米的表型鑒定

玉米粗縮病發(fā)病規(guī)律為苗齡越小，發(fā)病越重。芽鞘期至2葉1心期感病多為絕產(chǎn)株。8葉期以后感病的植株病情顯著減輕。11葉以后基本無癥狀，極少數(shù)顯癥株也均為1級輕病株。

根據(jù)山東省往年玉米粗縮病發(fā)病情況，選擇5月14號播種，野生型玉米與人工miRNA載體轉(zhuǎn)基因玉米隔行播種，7月下旬觀察人工miRNA載體轉(zhuǎn)基因玉米與野生型玉米生長情況，按照按0?4級的分級標準調(diào)查玉米粗縮病的嚴重度，掛牌標記調(diào)查株的病級。調(diào)查結果顯示 (圖5–6)，野生型玉米無健株，100%發(fā)病，且4級重度感染株比例較高，占37.5%，轉(zhuǎn)基因玉米抗病表現(xiàn)好于野生型玉米，幾乎沒有4級重度感染株。其中S6-miR159載體轉(zhuǎn)基因玉米健株 (0級) 和輕微感病株 (1級) 比例達到41.5%，為4個載體轉(zhuǎn)基因玉米中最高，抗病情況最好。轉(zhuǎn)基因玉米植株也存在一定比例的2級和3級感病株，可能是轉(zhuǎn)基因玉米單株之間存在miRNA表達量差異，miRNA表達量較少，干擾能力弱導致。

3 討論

長期以來，玉米粗縮病的防治措施主要以農(nóng)業(yè)防治，例如調(diào)整播期、清除雜草、及時拔除田間病株等措施，和關鍵期的藥劑處理為主，然而，這些措施不但限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并且化學農(nóng)藥種類的增多與濫用又使食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留與環(huán)境污染問題日趨嚴重。由于缺少優(yōu)良的抗病自交系，利用傳統(tǒng)的雜交育種培養(yǎng)抗玉米粗縮病品種面臨著巨大的挑戰(zhàn)。相比傳統(tǒng)雜交育種，利用基因工程技術手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑。

圖4 部分T2代轉(zhuǎn)基因苗miRNA表達量檢測

圖5 轉(zhuǎn)基因玉米抗粗縮病病株級別統(tǒng)計

圖6 轉(zhuǎn)基因玉米抗粗縮病表型鑒定

隨著病毒基因組研究的深入，病毒基因工程成為了培養(yǎng)抗病品種的工具，目前利用基因工程改良作物抗病性的手段主要有3種：1) 將植物病毒的衣殼蛋白基因 (Coat protein，CP)、復制酶基因、核酶基因等構建到植物表達載體中，通過表達病毒衣殼蛋白、復制酶基因和核酶基因等而使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生對多種病毒的抗性；2) 利用RNA干擾 (RNA interference，RNAi)的原理，設計病毒基因的反向重復序列，構建植物表達載體轉(zhuǎn)化得到對病毒免疫的轉(zhuǎn)基因植株[15]；3) 通過修飾植物microRNA的前體，構建針對目標病毒的功能基因或者基因沉默抑制子基因的編碼序列的人工miRNA表達載體，轉(zhuǎn)化植物并獲得具有抗病毒能力的轉(zhuǎn)基因植株。目前，前2種策略研究比較深入，但這2種方法也各有其弊端：病毒RNA介導的轉(zhuǎn)基因植物的抗病性和外源基因插入的拷貝數(shù)有密切的聯(lián)系，轉(zhuǎn)基因后代的安全性、抗病穩(wěn)定性、抗性水平和遺傳性也備受質(zhì)疑；利用PTGS (RNAi) 介導的植物抗性具有抗病性強、抗性持久、生物安全性高等特點。但是許多病毒能夠編碼抑制蛋白，抑制宿主的RNA干擾機制，此外還會產(chǎn)生一系列序列信息不明確的siRNAs，這種不確定性大大降低了RNA沉默的精確度。另一方面，可能產(chǎn)生次級的siRNAs，造成非目標基因的沉默，使結果變得復雜[16-20]。這3種方法的原理都是通過病毒基因的沉默，達到植物的范疇。但是，人工miRNA方法的原理是miRNA介導的基因沉默途徑，由于引入植物體的外源基因片段只有21 bp左右，引起植物內(nèi)源基因沉默的幾率大大降低，而且這21 bp的序列是已知的，通過全基因組比對可以對21 bp的成熟體序列作出較為準確的預測。第1種和第2種方法的原理都是RNAi介導的基因沉默途徑，互補的雙鏈RNA在植物體內(nèi)被加工成一系列22 nt左右的RNA片段，這一系列22 nt的雙鏈RNA片段和植物內(nèi)源基因互補配對的幾率增加，更容易造成植物內(nèi)源基因的沉默。

本研究獲得的人工miRNA抗粗縮病轉(zhuǎn)基因玉米株系，對玉米粗縮病毒有顯著抗性，其中S6-miR159載體抗性較顯著。因此人工miRNA載體轉(zhuǎn)化玉米，可以對粗縮病毒起到較好的干擾作用。

本文中人工miRNA載體的構建，采用玉米自身的miRNA前體作為骨架，和傳統(tǒng)的通過引入外源基因改良作物品質(zhì)有很大不同，一定程度上可以減少引入外源基因造成的不確定表型，也可以避免轉(zhuǎn)基因的爭議。相比PTGS (RNAi) 介導的基因沉默，人工miRNA在培養(yǎng)抗病毒植物上具有其獨特的應用優(yōu)勢：1) RNAi介導的基因沉默依賴DCL4途徑，而病毒編碼的抑制蛋白 (基因沉默抑制子) 可以抑制這種沉默，能夠抑制RNAi機制的發(fā)生。人工miRNA通過DCL1途徑，可以避開一些病毒抑制蛋白的拮抗作用；2) RNAi介導的基因沉默在植物中轉(zhuǎn)錄長片段病毒基因組，這些病毒基因組序列可能與植物基因組重組，存在一些生物安全方面的隱患，而人工miRNA只引入21個堿基的外源序列，降低了此類風險的發(fā)生；3) 田間病毒多是混合侵染，病毒株系多、變異快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，無法培育一種持久廣譜的抗病毒品種，amiRNA可以允許錯配的存在，因而針對病毒保守區(qū)設計amiRNA，使之有效抑制大多數(shù)病毒株系，并且當病毒發(fā)生突變后仍然能夠保持抗病毒能力；4) RNAi介導的基因沉默會產(chǎn)生一系列序列信息不明確的siRNAs，往往造成意外“脫靶”和非目標基因的沉默等現(xiàn)象，amiRNA只產(chǎn)生1條miRNA成熟體 (Mature miRNA)，與靶基因的結合更加精確、可控和高效。

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(本文責編 陳宏宇)

Development of transgenic maize with anti-rough dwarf virus artificial miRNA vector and their disease resistance

Ning Xuan1, Chuanzhi Zhao1, Zhenying Peng1, Gao Chen1, Fei Bian1, Mingzheng Lian1, Guoxia Liu1, Xingjun Wang1, and Yuping Bi1,2

1,,250100,,2,,250100,,

Maize is one of the most important food crops. Rice black-streaked dwarf virus is a maize rough dwarf disease pathogen. The occurrence and transmission of maize rough dwarf disease brings great damage to maize production. The technology of using artificial miRNA to build antiviral plant has been proven effective in a variety of plants. However, such trials in maize have not been reported. We designed primers based on the sequence of maize zea-miR159a precursor and sequence of function protein genes and silencing RBSDV coding genes in RBSDV genome. We constructed amiRNA (artificial miRNA) gene for silencing RBSDV coding gene and gene silencing suppressor. We constructed pCAMBIA3301-121-amiRNA plant expression vector for transforming maize inbred lines Z31 by using agrobacterium mediated method. After molecular analysis of transgenic maize, homozygous lines with high miRNA expression were selected by molecular detection for a subsequent natural infection experiment. We studied the severity of maize rough dwarf disease according to a grading standard (grade 0 to 4). The experiment results showed that the disease resistance of transgenic homozygous maize with the anti-rough dwarf virus amiRNA vector was better than that of wild type. Among the transgenic maize, S6-miR159 transgenic maize had high disease resistance. It is feasible to create new maize variety by the use of artificial miRNA.

amiRNA, maize rough dwarf disease, transgenic maize

10.13345/j.cjb.140637

December 24, 2014; Accepted:May 6, 2015

International Science & Technology Cooperation Program of China (No. 2012DFA30450), Foundation for Young Excellent Scientists in Shandong Province (No. BS2012SW019).

Yuping Bi. Tel: +86-531-83178227; E-mail: yupingbi@vip.sina.com

國家國際科技合作專項項目(No. 2012DFA30450)，山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金(No. BS2012SW019) 資助。

2015-06-26

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150626.1512.002.html