Cx43基因修飾對人肺鱗癌NCI－H226細胞增殖和遷移能力的影響

Cx43 基因修飾對人肺鱗癌NCI-H226細胞增殖和遷移能力的影響

勾建強張秀義

(承德市中心醫(yī)院呼吸內科，河北承德067000)

摘要〔〕目的通過重組質粒pBudCE4.1-Cx43轉染人肺鱗癌NCI-H226細胞，探討Cx43基因對細胞的生長、細胞周期及腫瘤遷移等的作用。方法用LipofectamineTM2000轉染的方法將重組表達質粒pBudCE4.1-Cx43轉染人肺鱗癌NCI-H226細胞,通過RT-PCR、Western印跡檢測Cx43在轉染后的mRNA和蛋白的表達情況，劃痕染料示蹤法檢測細胞間通訊功能，流式細胞儀檢測細胞周期并通過CCK-8 增殖實驗、劃痕愈合實驗、細胞侵襲實驗評價轉染Cx43基因對人肺鱗癌NCI-H226細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。結果實驗組Cx43 mRNA和蛋白表達較對照組和空白組顯著升高(P<0.05)；細胞傳遞的熒光強度較對照組和空白組顯著升高(P<0.01)，實驗組細胞的生長速度明顯減慢，細胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。與對照組和空白組相比，實驗組NCI-H226細胞增殖受到明顯抑制(P<0.001)，尤以72 h 為著。實驗組遷移能力、NCI-H226細胞的侵襲能力顯著下降(P<0.05)。結論轉染Cx43基可抑制人肺鱗癌NCI-H226細胞的遷移能力，并抑制腫瘤細胞增殖。

關鍵詞〔〕肺鱗癌;縫隙連接蛋白43;轉染；NCI-H226細胞；細胞增殖

中圖分類號〔〕R734.2〔

Doi7Ruttenstock EM,T,Dingemann J, et al.Prenatal retinoic acid upregulates connexin 43 (Cx43) gene expression in pulmonary hypoplasia in the nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia rat model〔J〕.J Pediat Surg,2012;47(2):336-40.

肺癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟的漸進過程，肺鱗癌是肺癌一種組織學類型，發(fā)病年齡逐漸年輕化,可出現(xiàn)淋巴或血行早期轉移〔1〕。隨著人類基因組計劃的完成和功能基因學的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖、遷移與基因調控密切相關，涉及多種基因復雜的激活、失活，提供了有效治療腫瘤新的途徑〔2，3〕?？p隙連接由細胞膜上整合膜蛋白-縫隙連接蛋白(Cx)亞單位構成，是相鄰細胞間的膜連接通道，包括Cx43，細胞通過它所介導的細胞縫隙連接通訊(GJIC)在細胞間傳遞信息和能量, 調控細胞的生長、增殖分化及內環(huán)境的穩(wěn)定，因此推斷如果阻斷腫瘤細胞中Cx43的表達能有效抑制腫瘤〔4〕。本實驗通過重組質粒pBudCE4.1-Cx43轉染人肺鱗癌NCI-H226細胞，評價其影響人肺鱗癌NCI-H226細胞增殖、侵襲、遷移的能力。

1材料與方法

1.1主要材料人肺鱗癌NCI-H226細胞購于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM (GIBCO BRL, 美國)、胎牛血清 (中國醫(yī)學科學院血液學研究所)；重組真核表達質粒pBudCE4.1-Cx43及空載質粒pbudCE4.1由天津腫瘤醫(yī)院劉鳳華老師饋贈；脂質體轉染試劑Lipofectamine2000TM(美國Gibco公司)；L質粒提取試劑盒、RNA 提取試劑Trizol、 G418、DNA凝膠純化回收試劑盒(南京凱基生物技術發(fā)展有限公司)；羅氏黃液(lucifer yellow，Sigma) DNA marker、RT-PCR兩步法試劑盒(美國Promcga公司)，cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉錄試劑盒(杭州博日)； PCR 引物序列(Invitrogen 公司化學合成)；CCK-8(上海炎彬化工公司)；兔抗人Cx43多克隆抗體(美國Abcam公司)；HRP 標記的羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz 公司)；鼠抗GAPDH 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP 標記的兔抗羊IgG(北京博奧森公司)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；Matrigel gel(美國B.D.公司)；ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)。

1.2Cx43 基因修飾肺鱗癌細胞株NCI-H226培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃ 5%CO2密閉式孵箱內培養(yǎng)，傳代。實驗時取對數(shù)生長期的細胞。按2×105個/孔將NCI-H226接種于6孔板中，當融合率達80%時以脂質體法進行轉染。轉染時分為3組：轉染pbudCE4.1-Cx43載體者為NCI-H226/pbudCE4.1-Cx43組(實驗組)，轉染空載質粒pbudCE4.1者為NCI-H226/control組(即對照組)，未轉染的肝癌NCI-H226為NCI-H226組(即空白組)。于轉染后48 h進行轉染效應的檢測。

1.3RT-PCR檢測細胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增Cx43和內參GAPDH。Cx43引物序列: 上游：5′-GTCGACATGGGTGACTGGAGCGCCTT-3，下游：5′-GCGGCCGCCTAGATCTCCAGGTCATCAGG-3＇，擴增產物為1 149 bp。GAPDH上游：5＇-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3＇，下游：5＇-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3＇，擴增產物為185 bp。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR產物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察電泳結果，UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7.0 軟件分析條帶灰度值，用Cx43/GAPDH 代表Cx43 mRNA的相對表達量。

1.4Western印跡檢測每組收集1×107個細胞，PBS沖洗3次，提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白質濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補至20 μl，入等體積2×上樣緩沖液，99℃變性10 min。離心后吸取30 μl上樣，經10%SDS-PAGE分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉，37℃封閉,2 h，加入1∶1 000稀釋的Cx43多克隆一抗，4℃過夜。TBST洗膜5次，每次5 min，加入1∶5 000 HRP標記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗滌，采用ECL法檢測。暗室曝光X線膠片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶灰度值，用Cx43/GAPDH代表代表Cx43的相對表達量。

1.5劃痕荷載染料傳輸試驗分別將3組細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞融合達到100%時，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入0.05%羅氏黃液，手術刀片在玻片上輕輕劃線數(shù)條，之后將細胞浸泡3 min，除去染料，PBS再洗3次，再加少量PBS濕潤細胞，熒光顯微鏡下觀察照相，從頭至尾隨機取10個區(qū)域拍照后用OLMPUS光學顯微鏡下觀察,Imagepro5.1圖像分析儀測定熒光強度，求其平均值，作為熒光的相對強度。

另外，在介紹紅色文化的名人時，在英譯版本中還省略了名人們的出生地點。比如“丁日昌（1823-1882），豐順人”“陳少白（1869-1934），新會人”“葉挺(1896-1946)，歸善（今惠陽）人”等，其中地點的翻譯均被省略，首先，外國游客對這些地點并不熟悉，所以沒有必要翻譯出來。并且，出生地點不屬于重要細節(jié)，省譯并不影響其紅色文化的傳播，對于多數(shù)外國游客而言，參觀游覽時，了解重點知識和細節(jié)才是最重要的。

1.6流式細胞儀檢測收集3組細胞，以冷PBS 洗滌2次,細胞沉淀用70%的冷乙醇(4℃) 混勻備用，洗滌細胞，再用PBS調細胞濃度為1×106/L與含50 μg/ml RNA酶的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)共同孵育30 min。100 μg/ ml(1 μg/ml)碘化丙啶(PI)進行細胞的DNA染色，暗室中放置1 h后通過流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復3次。

1.7CCK-8檢測指數(shù)生長期細胞接種于96孔板，調整細胞密度每孔達到2×103，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，每組設6個復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱溫育4 h后，以不加細胞空白孔為對照，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度A值。以細胞吸光度A值平均值為縱坐標，以時間48、72、96及120 h為橫坐標繪制生長曲線。

1.8細胞劃痕損傷實驗取對數(shù)生長期將上述3組細胞分別以5×103個/孔的密度接種于6孔板，待培養(yǎng)的3組細胞生長形成細胞單層后，用10 L的液槍頭單層細胞上呈“一”字劃痕。PBS輕柔洗滌，每孔加入2 ml不含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48 h后倒置顯微鏡100倍下觀察細胞遷移情況。

1.9小室侵襲實驗在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按上述3組處理過的NCI-H226細胞懸液100 μl(細胞總數(shù)為3×105/L)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，以棉簽小心刮除濾膜上室面未穿過的瘤細胞，95%乙醇固定5 h，PBS輕輕漂洗3遍，蘇木精染色10 min，用BS沖洗小室，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上(膜內面朝上)，封片；干燥后在200×光鏡下每膜計數(shù)上、下、左、右、中5個視野的侵襲細胞數(shù)，計算平均值。每組平行設3個小室，重復3次。

1.10統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2.1Cx43 mRNA的表達與對照組(0.38±0.07)和空白組(0.37±0.08)比較，實驗組Cx43 mRNA表達(0.82±0.12)的條帶明顯變寬(P<0.05)。見圖1。

2.2Cx43蛋白的表達與對照組(0.65±0.08)和空白組(0.66±0.09)比較，實驗組條帶Cx43蛋白表達(1.11±0.11)明顯變寬(P<0.05),見圖2。

圖1　RT-PCR檢測NCI-H226細胞中Cx43 mRNA的表達

2.3劃痕荷載染料傳輸試驗熒光染料傳遞表明，對照組和空白組細胞通訊缺失，實驗組轉染pbudCE4.1-Cx43后的細胞通訊功能明顯恢復，即劃痕細胞內的熒光染料可傳遞至毗鄰3～4列細胞，見圖3。

圖2　Western印跡檢測NCI-H226細胞中Cx43蛋白表達

圖3　3組細胞通訊功能(×200)

2.4細胞周期檢測G0/G1期，實驗組較對照組和空白組略有增加，S期略有減少(P<0.05)，M期細胞無明顯變化(P>0.05)。表明Cx43 基因修飾將細胞周期阻滯在G0/G1期，見表1。

2.5對細胞增殖的影響實驗組較對照組和空白組曲線明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1　Cx43 基因修飾對NCI-H226細胞周期的影響

與空白組、對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2　3組OD450 nm吸收值比較

2.6細胞劃痕損傷實驗48 h后實驗組細胞劃痕愈合緩慢，而對照組和空白組細胞劃痕已基本長滿，見圖4。

2.7NCI-H226細胞體外侵襲力的變化對照組和空白組穿過濾膜的細胞數(shù)量較多分別為(64.34±3.65)和(65.21±4.70)個/40倍視野，實驗組穿膜細胞數(shù)明顯減少至(27.48±4.54)個/40倍視野(P<0.05)，表明Cx43 基因修飾能有效地降低NCI-H226細胞的侵襲力。見圖5。

圖4　3組細胞劃痕損傷實驗結果(×40)

圖5　3組小室侵襲實驗結果(×40)

3討論

肺癌患者可出現(xiàn)淋巴或血行早期轉移〔1〕。目前臨床醫(yī)生主要采取手術治療、化療、放療、內分泌治療、生物分子靶向治療等綜合治療方案，但其局部復發(fā)、遠處轉移是復雜的生物學過程〔5〕。肺鱗癌是肺癌一種組織學類型。隨著人類基因組計劃的完成和功能基因科學的發(fā)展，醫(yī)學界非常重視腫瘤的基因方面治療〔2〕。肺鱗癌的增殖、侵襲、遷移涉及多種基因功能及結構的異常，明確肺鱗癌發(fā)病中的關鍵基因對治療肺鱗癌意義重大〔6〕。

細胞連接主要包括縫隙連接、緊密連接、橋粒連接三種〔7〕?？p隙連接主要參與正常細胞間的能量物質交換和信息交流,調控細胞的增殖、分化、維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝等生理過程，在細胞膜中Cx43是主要構成縫隙連接蛋白亞單位〔8〕。腫瘤的發(fā)病、轉移與腫瘤細胞增殖失控和異常分化有關〔9〕。研究表明〔10，11〕，Cx43在正常細胞中陽性表達， Cx43在腫瘤細胞中表達明顯下降，導致了最重要的細胞間接觸抑制在腫瘤細胞中消失，腫瘤細胞間的結合能力下降，提示Cx43基因表達下調導致GJIC功能異?；蛳?，使正常細胞逃避生長控制及免疫監(jiān)視，使腫瘤細胞生長過度并易于擴散和轉移，參與腫瘤的發(fā)病、轉移，是近些年來被發(fā)現(xiàn)新的抑制腫瘤基因。近些年來隨著RNA干擾技術的發(fā)展，成為腫瘤基因治療研究中的熱點，由dsRNA分子介導的轉錄后沉默基因能高效、特異的抑制多種與腫瘤發(fā)病有關的基因表達，達到有效治療腫瘤的目的〔12〕。

綜上，Cx43的表達下降與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關。Cx43基因修飾后可抑制人肺鱗癌NCI-H226細胞的增殖、遷移能力。

4參考文獻

1Feist A,Lee R,Osborne S,etal.Increased incidence of cutaneous squamous cell carcinoma in lung transplant recipients taking long-term voriconazole〔J〕.J Heart Lung Transpl,2012；31(11):1177-81.

2Bastide K,Ugolin N,Levalois C,etal.Are adenosquamous lung carcinomas a simple mix of adenocarcinomas and squamous cell carcinomas，or more complex at the molecular level〔J〕?Lung Cancer,2010；68(1):1-9.

3Kunert-Keil C,Steinmüller F,Jeschke U,etal.Immunolocalization of glycodelin in human adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung and lung metastases of colonic adenocarcinoma〔J〕.Acta Histochem,2011；113(8):798-802.,Steinmüller F,Jeschke U,etal.Immunolocalization of glycodelin in human adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung and lung metastases of colonic adenocarcinoma〔J〕.Acta Histochem,2011；113(8):798-802.

4Wayakanon P,Bhattacharjee R,Nakahama K,etal.The role of the Cx43 C-terminus in GJ plaque formation and internalization〔J〕.Biochem Biophys Res Comm, 2012；420(2):456-61.

5Ho CF,Chan KW,Yeh HI,etal.Ketone bodies upregulate endothelial connexin 43 (Cx43) gap junctions〔J〕.Veteri J,2013；198(3):696-701.

6Chen XS,Zhang YG.Myocardial Cx43 expression in the cases of sudden death due to dilated cardiomyopathy〔J〕.Forensic Sci Int, 2006;162(1-3):170-3.

8Ton QV,Kathryn Iovine M.Semaphorin 3d mediates Cx43-dependent phenotypes during fin regeneration〔J〕.Develop Biol,2012;366(2):195-203.

9Teixeira TF,da Silva TC,Fukumasu H,etal.Histological alterations in the livers of Cx43-deficient mice submitted to a cholestasis model〔J〕.Life Sci, 2007;81(5):380-4.

10Solan JL,Lampe PD.Specific Cx43 phosphorylation events regulate gap junction turnover in vivo〔J〕.FEBS Lett, 2014;588(8):1423-9.

11Moore JC,Tsang SY,Rushing SN,etal.Functional consequences of overexpressing the gap junction Cx43 in the cardiogenic potential of pluripotent human embryonic stem cells〔J〕.Biochem Biophy Res Commu,2008;377(1):46-51.

12Neuhaus J,Heinrich M,Schwalenberg T,etal.TGF-β1 inhibits Cx43 expression and formation of functional syncytia in cultured smooth muscle cells from human detrusor〔J〕.Eur J Urol,2009;55(2):491-8.

〔2013-12-26修回〕

(編輯苑云杰)