鹽霉素對低分化鼻咽癌干細胞放療敏感性的影響

鹽霉素對低分化鼻咽癌干細胞放療敏感性的影響

甘生敏羅超李娟劉雙李亞軍李少林彭志平

(重慶醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院放射醫(yī)學與腫瘤學教研室,重慶400016)

摘要〔〕目的探討鹽霉素對低分化鼻咽癌干細胞放療敏感性的影響。方法將鼻咽癌干細胞懸液放入標有1～24的孔板中培養(yǎng)，其中1～12為對照組，13～24為實驗組，其中向?qū)φ战M加入200 μl的PBS緩沖液，向?qū)嶒灲M加入200 μl終濃度為2 μmol/L的鹽霉素，適宜環(huán)境中培養(yǎng)12 h后，兩組細胞均給予6 Gy單次照射，放療結(jié)束后，接種至培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)2 w，GIEMSA染色，計算細胞存活分數(shù)(SF)，采用RT-PCR及 Western印跡法檢測選取培養(yǎng)24 h后人鼻咽癌干細胞中Rad51、Ku70、Ku80基因及蛋白表達水平。結(jié)果實驗組培養(yǎng)皿中細胞SF明顯低于對照組(P<0.05)。實驗組培養(yǎng)皿鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表達水平低于對照組(P<0.05)。實驗組培養(yǎng)皿鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論鹽霉素能夠明顯抑制人低分化鼻咽癌干細胞中Rad51、Ku70和Ku80表達，降低細胞存活分數(shù)，提高放療敏感性和臨床療效。

關(guān)鍵詞〔〕鹽霉素；鼻咽癌；放療；敏感性

中圖分類號〔〕R739.63〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81171365)

通訊作者：彭志平(1971-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤放射治療臨床及基礎(chǔ)研究。

第一作者：甘生敏(1987-)，女，碩士,醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療學研究。

Effects of salinomycin on radiation sensitivity of low differentiation nasopharyngeal carcinoma stem cells

GAN Sheng-Min, LUO Chao, LI Juan,etal.

Department of Radiation Medicine and Oncology, Basic College of Chongqing Medical Universtiy, Chongqing 400016, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of salinomycin on radiation sensitivity of low differentiation nasopharyngeal carcinoma stem cells.MethodsNasopharyngeal carcinoma stem cell suspension were put into orifice plate marked with 1～24, plated with 1～12 were selected as the control group, with 13～24 were selected as the experimental group. 200 μl PBS were added into control group, 200 μl salinomycin (concentration was 2 μmol/L) were added into experimental group. Cells were cultured into suitable environment for 12 h, and were given 6 Gy single radiation therapy. After radiation therapy, cells were cultured into petri dish for 2 weeks. Cell survival fraction (SF) was calculated by GIEMSA staining, Rad51, Ku70, Ku80 gene and protein expression were detected by RT-PCR and Western blot after cultured 24 h.ResultsSF in experimental group was lower than that of control group (P<0.05). Expression of Rad51, Ku70, Ku80 mRNA in experimental group were lower than those of control group (P<0.05). Expression of Rad51, Ku70, Ku80 protein in experimental group were lower than those of control group (P<0.05).ConclusionsSalinomycin could significantly inhibit the expressions of Rad51, Ku70 and Ku80 in low differentiation nasopharyngeal carcinoma cells, reduce the SF, improve radiation sensitivity and clinical curative effect.

【Key words】Salinomycin; Nasopharyngeal carcinoma; Radiation therapy; Sensitivity

鼻咽癌(NPC)是我國常見發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤〔1〕。本病臨床表現(xiàn)為鼻塞、涕血、鼻出血、耳悶堵感、聽力下降、頭痛、復視等〔2〕。本病多發(fā)于中老年人群，其發(fā)病與遺傳因素、病毒感染及環(huán)境因素關(guān)系密切。鼻咽癌是多因素、多效應(yīng)、多基因和多階段共同作用的結(jié)果〔3〕。鼻咽癌是目前能夠治愈的惡性腫瘤之一，絕大多數(shù)鼻咽癌對放療較敏感，因此現(xiàn)代醫(yī)學中是以放療為主，化療及手術(shù)為輔助的治療手段。隨著醫(yī)療工作者對鼻咽癌探索，更加注重提高本病的放療敏感性，有相關(guān)資料證明，鹽霉素具有抑制腫瘤干細胞的作用，其抑制乳腺癌肝細胞比抗癌藥泰克索高出百倍〔4〕。為了研究鹽霉素對鼻咽癌放療的敏感性，本研究檢測鼻咽癌干細胞中的Rad51、Ku70和Ku80的表達情況，探討鹽霉素對低分子鼻咽癌干細胞放療敏感性的影響。

1資料與方法

1.1一般資料人低分化鼻咽癌干細胞株由本實驗室構(gòu)建，鹽霉素、DMEM/ F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RMPI1640培養(yǎng)基、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)(Gibco公司)，表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)(Peprotech公司)，B27(Invitrogen公司)，Accutase(Gibco公司)，Cell Culture Inserts(Thermo公司)，Trizol試劑購于購于美國Hyclone公司；RT-PCR試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于美國Amresco公司；Rad51抗體、Ku70抗體、Ku80抗體、引物、Tap酶和DAB顯色劑購于美國BD bioscience公司。X線直線加速器：美國Varian 23EX。RMPI1640培養(yǎng)基中加入10%的FBS和雙抗配制成完全培養(yǎng)液(SSM)。DMEM/F12培養(yǎng)液中加入雙抗、20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、2%的B27，配制成無血清培養(yǎng)液(SFM)。鹽霉素溶于DMSO(2 mmol/L)。

1.2鼻咽癌細胞培養(yǎng)及處理方法無菌操作下，取人低分子鼻咽癌干細胞株置于SSM(含血清的1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，置于37℃，體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天半量換液1次，待細胞生長至80%左右時，傳代培養(yǎng)，傳代時將細胞微球收集至離心管中，自然沉降20 min或800 r/min離心3 min，機械吹打成單細胞懸液，按1∶3傳代至新的培養(yǎng)瓶中，再每瓶分別加入3～5 ml新鮮SFM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。照射方法：6MV-X，機架旋轉(zhuǎn)180°，射野10×10 cm，源皮距(SSD)100 cm，劑量率200 cGy/min。照射時培養(yǎng)板下放置1.5 cm厚等效組織補償物，待細胞靜置20 min后開始照射。

取對數(shù)生長期的低分化鼻咽癌干細胞，機械吹打成單細胞懸液，離心，收集后，加入10%體積分數(shù)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成細胞懸液，在預(yù)先準備好的24孔板(標有1～24數(shù)字，其中1～12為對照組，13～24為實驗組)內(nèi)加入200 μl濃度為4×104/ml的鼻咽癌干細胞懸液，置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，接種12 h后，待24孔板細胞貼壁后，抽取并除去培養(yǎng)液，向?qū)嶒灲M加入終濃度為2 μmol/L的鹽霉素，相應(yīng)對照組加入等量的PBS緩沖液。培養(yǎng)24 h后，兩組細胞均給予6 Gy單次照射，放療結(jié)束后，收集細胞，離心，機械吹打成單細胞懸液，將對照組細胞接種至A培養(yǎng)皿中，實驗組細胞接種至B培養(yǎng)皿中，添加SFM培養(yǎng)基，將A、B兩培養(yǎng)皿移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)2 w后終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液浸洗2次，甲醇固定，GIEMSA染色，空氣干燥。計算細胞存活分數(shù)(SF)。

1.3RT-PCR法檢測人低分子鼻咽癌干細胞中Rad51、Ku70、Ku80基因表達水平

1.3.1總RNA的提取分別取A、B兩培養(yǎng)皿人低分子鼻咽癌干細胞于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hanks液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取人鼻咽癌干細胞中總RNA。實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的OD260/OD280確定總RNA純度。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作，按照相關(guān)文獻資料設(shè)計聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中內(nèi)參照Rad51、Ku70、Ku80和GAPDH引物，將RNA模板、引物、5倍緩沖液和RNase-free水溶解并置于冰上備用，將2 μl Primer mix試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應(yīng)體系的第一部分，混勻。PCR反應(yīng)體系為：稀釋后Template(cDNA)2 μl，正義鏈Primer(10 μmol/L)0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq TMⅡ(2×)10 μl，反義鏈Primer(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，dH2Oto final volume To 20 μl。經(jīng)過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，PCR循環(huán)條件為94℃30 s，57℃20 s，72℃27 s，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。引物序列見表1。

1.3.3結(jié)果分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較Rad51、Ku70和Ku80產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與GAPDH條帶光密度值比較，計算出Rad51、Ku70和Ku80在人鼻咽癌干細胞中mRNA表達含量相對值。

1.4Western印跡法檢測人鼻咽癌干細胞中Rad51、Ku70和Ku80蛋白表達無菌操作下，分別取A、B兩培養(yǎng)皿人鼻咽癌干細胞，將選取好的人鼻咽癌干細胞經(jīng)PBS緩沖液洗滌，洗滌后離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液，即胞質(zhì)蛋白。采用BCA法對樣品蛋白質(zhì)進行蛋白定量。調(diào)整樣品蛋白量為30～40 μg后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min后，PBST溶解封閉PVDF膜2 h。繼而加入Rad51抗體、Ku70抗體、Ku80抗體(按1∶1 000稀釋)或抗β-actin(1∶2 000稀釋)，置于4℃環(huán)境中過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBST洗滌3次，每次10 min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PBVF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

表1　目的基因的實時定量RT-PCR引物序列

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1兩組培養(yǎng)皿中人低分子鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表達及SF比較實驗組培養(yǎng)皿人低分子鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA表達水平及SF明顯低于對照組(P<0.05)。見表2，圖1。

表2　人鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80 mRNA

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

圖1　人低分子鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和 Ku80產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2兩組培養(yǎng)皿中人低分子鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表達比較實驗組培養(yǎng)皿人低分子鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80蛋白表達水平明顯低對照組培養(yǎng)皿，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3　人鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和

圖2　鼻咽癌干細胞Rad51、Ku70和Ku80 蛋白表達

3討論

鼻咽癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為耳鼻喉惡性腫瘤之首，是鼻咽腔頂部及側(cè)壁惡性病變而發(fā)生的惡性腫瘤，常常導致鼻塞、鼻出血、聽力下降、復視、頭痛等癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量。絕大多數(shù)病理類型的鼻咽癌因?qū)Ψ派渲委熡休^強敏感度，故目前臨床鼻咽癌以放射治療為主要，化學治療及手術(shù)治療為輔助治療的治療策略〔5〕。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，探索提高本病放療的敏感性是目前的重點研究方向。研究表明，鹽霉素在抑制乳腺癌干細胞上比普通的抗癌藥物高出100倍〔6〕。 放射線治療是使用放射線對腫瘤細胞DNA的損傷，主要是DSBs的損傷，而放射敏感性也主要與放射治療后細胞DSBs損傷的修復程度〔7〕。放射治療后細胞DSBz的修復途徑主要由兩條〔8〕，一是通過HR修復，二是通過NHEJ修復，而HR修復是細胞DSBs修復的主要修復機制，Rad51蛋白是HR修復機制中必不可少的元素〔9〕；在NHEJ修復途徑中，DNA-PK是參與修復過程中的重要分子之一，而DNA-PK是由DNAP-PKCs和Ku70、Ku80共同催化調(diào)節(jié)而成，并且輔助因子Ku70、Ku80在DSBs修復過程中國起到重要的作用〔10〕。當細胞中Rad51、Ku70和Ku80缺乏時，細胞DSBs修復能力明顯下降，從而增強放射治療對腫瘤細胞的殺傷力〔11〕。本研究中，鹽霉素處理后的低分子鼻咽癌干細胞經(jīng)過6 Gy放療后，細胞中Rad51、Ku70和Ku80的mRNA和蛋白水平與單純接受放療的低分子鼻咽癌干細胞基因和蛋白表達水平明顯下調(diào)，且細胞SF亦明顯下降。Rad51是HR修復途徑的重要因子，采用鹽霉素處理后，Rad51表達明顯下調(diào)，鹽霉素可能是通過抑制Rad51蛋白的表達，抑制DSBs修復的主要HR修復途徑〔12〕；Ku70和Ku80是NHEJ重要參與分子，通過鹽霉素處理后，鼻咽癌干細胞中Ku70和Ku80表達明顯下調(diào)，這可能與鹽霉素能夠抑制NHEJ修復途徑，進而抑制細胞DSBs的修復〔13，14〕。鹽霉素通過抑制DSBs修復途徑中的重要因子的表達，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用，增強放療對低分子鼻咽癌的放療敏感。

綜上所述，鹽霉素抑制鼻咽癌干細胞中Rad51、Ku70和Ku80蛋白的表達，抑制細胞DSBs修復途徑，從而增強放射治療對鼻咽癌干細胞DNA的損傷，發(fā)揮抗腫瘤的作用，提高低分子鼻咽癌干細胞對放療敏感性，提高鼻咽癌的臨床治療療效，改善預(yù)后。對鼻咽癌臨床治療及其預(yù)后有重要指導意義。

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〔2013-12-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)