三氯化鋁比色測定火棘總黃酮方法的系統(tǒng)考察

鄢又玉，夏婷，張育，游元，趙春芳，余龍江，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

三氯化鋁比色測定火棘總黃酮方法的系統(tǒng)考察

鄢又玉1，2，夏婷2，張育2，游元2，趙春芳1，余龍江1，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

探討以蘆丁作為對照品，建立三氯化鋁（AlCl3）比色法測定火棘總黃酮含量的最優(yōu)條件。系統(tǒng)考察了對照品、光照、反應(yīng)時(shí)間及溫度、顯色劑AlCl3濃度及用量、體系pH、緩沖液用量等因素對總黃酮與AlCl3顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，AlCl3比色法測定火棘總黃酮含量的最優(yōu)條件為：1mL適宜濃度的火棘提取液，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL質(zhì)量濃度2%AlCl3液，70%乙醇定容至10mL并混勻，不避光條件下30℃反應(yīng)12min，285 nm測定吸光度。該測定方法具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，回收率。

火棘；總黃酮；蘆丁；AlCl3比色法

火棘（P yracantha fortuneana）屬于薔薇科蘋果亞科（Maloideane），是一種藥食兩用常綠野生灌木，在我國共有7個種屬，廣泛分布于東南、西南和西北部，尤以湖北神農(nóng)架地區(qū)資源最豐富，年均產(chǎn)量在5萬t以上[1]?；鸺缓S酮類[2]等天然抗氧化成分，研究表明，黃酮類化合物具有增強(qiáng)記憶[3]、抗衰老[4-5]、抗疲勞[6]、消食健脾[7]、通便潤腸、降血脂[8]、抗菌[9]、改善脂蛋白、保護(hù)心肌及抗糖尿病等[10]功效。目前，火棘資源在日本、韓國等已開發(fā)得相當(dāng)成功，廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品[11]等領(lǐng)域，而在中國大陸火棘整體開發(fā)力度不夠，僅以盆景，果酒[12]，果醋[13]以及果實(shí)粗提物低端應(yīng)用及出口，具有極大的開發(fā)潛力，市場前景相當(dāng)廣闊。植物總黃酮的含量測定一般采用直接分光光度法、比色法、高效液相色譜（HPLC）法等[14-18]。直接分光光度法靈敏度低，比色法能提高測定靈敏度，是被《中國藥典》所采用的最常見的總黃酮測定方法，其中又以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法最常用，但NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法不能排除鄰二酚羥基非黃酮類物質(zhì)的干擾[19-20]，而火棘中已經(jīng)報(bào)道的很多非黃酮成分如鞣酸、山奈酚及反式肉桂酸等均具有鄰二酚羥基[21]，因此，使用該方法專屬性不強(qiáng)，不適合于火棘總黃酮的測定。HPLC法測得的結(jié)果相對準(zhǔn)確，但其所需單體不易得到且所用儀器費(fèi)用較高，難以滿足一般產(chǎn)業(yè)化的需求。黃榮[22]及甘秀海[23]等學(xué)者對火棘總黃酮含量測定進(jìn)行了相關(guān)研究，前者粗略比較了亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法與AlCl3比色法，且只對AlCl3比色法中體系pH對測定結(jié)果的影響進(jìn)行了初步探討，并未展開系統(tǒng)而深入的研究；后者肯定了以AlCl3-NaAc為顯色體系的紫外分光光度測定法，卻對影響含量測定的相關(guān)因素只字未提，兩篇文章均未給出火棘總黃酮測定的最優(yōu)參數(shù)條件。因此，本課題在他們研究的基礎(chǔ)上，采用AlCl3比色法測定火棘總黃酮含量，并對影響測定的相關(guān)因素如對照品、體系pH、顯色劑濃度及用量、反應(yīng)時(shí)間及溫度等展開系統(tǒng)而深入的考察，最終建立了火棘總黃酮含量測定的最優(yōu)條件。該方法簡便可行，具有良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，可作為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)火棘總黃酮含量測定的首選方法之一。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火棘果，2012年11月中旬采自湖北恩施來鳳地區(qū)，經(jīng)華中科技大學(xué)植物學(xué)博士楊悅鑒定為全緣火棘（Pyracanthaatalantioides（Hance）Stapf）。去離子水，無水乙醇，無水氯化鋁，結(jié)晶乙酸鈉，醋酸等均為分析純；蘆丁對照品，槲皮素對照品：中國藥品生物制品檢定所。

萬分之一分析天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PE-Lambda25紫外-可見光光度計(jì)：美國PE公司；DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 火棘提取物制備

取過20目篩、干燥去籽的火棘果粉末50 g，加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），80℃水浴加熱回流提取2 h，過濾離心后取上清液，以70%乙醇定容至500mL，稀釋10倍后作為儲備液待用，此時(shí)火棘提取物濃度記為10mg/mL。

1.2.2 對照品的選擇及最大吸收波長的確定

分別吸取折算后實(shí)際濃度0.05mg/mL蘆丁、槲皮素溶液各5mL，置于25mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，2%AlCl3溶液（2 g無水AlCl3，以70%乙醇定容至100mL）10mL，70%乙醇定容，快速混勻后室溫靜置12min。同時(shí)做空白試驗(yàn)，在200 nm～700 nm范圍進(jìn)行全波段掃描，譜圖參見圖1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0.15mg/mL蘆丁對照品液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0mL于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻后，30℃靜置12min。以不加對照品的溶液作空白對照，在285 nm測吸光度，以蘆丁樣液濃度C（mg/mL）對吸光度值（A）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 AlCl3法測定火棘總黃酮的影響因素考察

1.2.4.1 顯色劑用量

準(zhǔn)確移取1mL樣品液置于10mL具塞比色管中，分別加入不同量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL）1% AlCl3溶液，混勻，30℃顯色反應(yīng)8min，70%乙醇定容待測；同時(shí)作空白對照，在285 nm測吸光度，每個樣品重復(fù)測3次，取平均值（以下所有測定均同上操作）。以吸光度值對顯色劑用量作圖，結(jié)果參見圖2。

1.2.4.2 顯色劑濃度

準(zhǔn)確移取1mL樣品溶液于10mL具塞比色管中，分別加入1m L 1%、2%、3%及4%AlCl3液，其他操作同1.2.4.1，以吸光度值對顯色劑用量作圖，結(jié)果參見圖3。

1.2.4.3 顯色時(shí)間

準(zhǔn)確移取1mL樣品溶液于10mL具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，室溫分別放置4、8、12、16、20min，70%乙醇定容待測，其他同上操作。以吸光度值對顯色劑用量作圖，結(jié)果參見圖4。

1.2.4.4 反應(yīng)溫度

準(zhǔn)確移取1m L樣品溶液于10m L具塞比色管中，加入1mLAlCl3溶液，分別在15、20、25、30、35、40℃下反應(yīng)12min，70%乙醇定容待測，其他同上操作。以吸光度值對顯色劑用量作圖，結(jié)果參見圖5。

1.2.4.5 體系pH

準(zhǔn)確移取1mL樣品液于10mL具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，分別加入pH為3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6的緩沖液2mL，室溫放置12min，70%乙醇定容待測，其他同上操作，以吸光度值對pH作圖，結(jié)果參見圖6。

1.2.4.6 緩沖液用量

準(zhǔn)確移取1m L樣品溶液于10m L具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，分別加入pH為5.4的緩沖液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL室溫放置12min，70%乙醇定容待測。其他同上操作，以吸光度值對緩沖液用量作圖，結(jié)果參見圖7。

1.2.5 測定方法評價(jià)

1.2.5.1 火棘提取液標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別量取濃度梯度為2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的火棘提取液1mL至10mL具塞比色管中，加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1 mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻，30℃反應(yīng)12min后測定，同時(shí)作空白對照，依1.2.3操作，從而確定待檢火棘提取液的線性濃度范圍。

1.2.5.2 方法重復(fù)性考察

取2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻，30℃反應(yīng)12min，測定A285，共測定5次。此測定在相同條件下由同一分析人員獨(dú)立完成。

1.2.5.3 方法穩(wěn)定性考察

取2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻，30℃反應(yīng)，每隔20分鐘測定一次A285，連續(xù)測定5次。測定結(jié)果之間的精密度稱為穩(wěn)定性。

1.2.5.4 方法重現(xiàn)性考察

取質(zhì)量濃度為2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻，30℃反應(yīng)12min，測定A285，共測定5次。此測定在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員完成，測定結(jié)果之間的精密度稱為重現(xiàn)性。

1.2.5.5 加樣回收率考察

取2mg/m L火棘提取液1m L，置于10m L具塞比色管中，加入2mLpH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混勻，30℃反應(yīng)12min，同時(shí)做空白對照，測定火棘提取液中總黃酮含量。再取2mg/mL火棘提取液1mL置于10mL具塞比色管中，加入0.015mg/mL蘆丁對照品1mL，按上述相同方法測定溶液中總黃酮含量，重復(fù)測定5次，計(jì)算回收率。

回收率/%=（加入蘆丁后火棘提取液總黃酮量-原火棘提取液中總酮量）/加入蘆丁量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 對照品的選擇及最大吸收波長的確定

按照1.2.2設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖1。

圖1 樣品、蘆丁及槲皮素標(biāo)樣紫外掃描圖Fig.1 UV spectrogram ofsample，rutin and quercetin standard

分析可知，同樣測試條件下，樣品，蘆丁和槲皮素在280 nm附近的吸收峰依次分別為285、274及275 nm；樣品在360 nm～380 nm處無明顯吸收峰，蘆丁及槲皮素在360、374 nm處有吸收峰。顯然，蘆丁作為對照品，顯色后紫外光譜圖更接近樣品；另外，火棘果中蘆丁含量相對槲皮素而言更高，故選擇蘆丁作為對照品更具有代表性，相對更合適。因此，選擇蘆丁作為對照品，測定最大吸收波長285 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.3設(shè)計(jì)，可得蘆丁樣液濃度C（mg/mL）對吸光度值（A）的線性回歸方程為A=11.22 0C+0.049 2（R2=0.998 3，n=7），結(jié)果表明蘆丁濃度在0.009mg/m L～0.045mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.1 顯色劑用量

按照1.2.4.1設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖2。

圖2 顯色劑用量影響Fig.2 Effectof the dosagesofalum inum ch loride

分析可知，待測樣品加入AlCl3液顯色后溶液的吸光度值隨著AlCl3用量的增加先快速增加，加入量為1mL時(shí)吸光度值達(dá)到最大，繼續(xù)增大AlCl3用量，吸光度值逐漸下降至最后持平狀態(tài)，此時(shí)，空白對照液顏色發(fā)生明顯變化，故選擇AlCl3用量1mL較合適。

2.3.2 顯色劑濃度

按照1.2.4.2設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖3。

分析可知，固定AlCl3加入量為1mL，隨其濃度增加，火棘提取液與之顯色反應(yīng)后溶液吸光度先快速增加，AlCl3濃度為2%時(shí)吸光度值達(dá)到最大，后隨著AlCl3濃度繼續(xù)增加而緩慢降低。因此在保證測試靈敏度高及空白對照液顏色不發(fā)生改變的前提下，選擇2% AlCl3較合適。

圖3 A lC l3濃度影響Fig.3 Effectof the concentration ofalum inum chloride

2.3.3 顯色時(shí)間

外面黑得像午夜，法比離開了英格曼神甫。他回過頭，見英格曼神甫走到受難圣像前，面對十字架慢慢跪下。法比此時(shí)還不知道在他和少佐說話時(shí)，一個念頭在神甫腦子里閃現(xiàn)了一下?，F(xiàn)在他要把那閃念追回來，仔細(xì)看看它，給它一番冷靜的分析。

按照1.2.4.3設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖4。

圖4 顯色時(shí)間的影響Fig.4 Effectof reaction time

分析可知，火棘提取物與AlCl3顯色反應(yīng)后溶液的吸光度隨著顯色時(shí)間的增加先快速增加，后緩慢降低，在顯色反應(yīng)12min時(shí)吸光度值達(dá)到最大。因此在保證較高的測試靈敏度及空白對照液顏色不發(fā)生顏色改變的前提下，顯色時(shí)間定為12min較合適。

2.3.4 反應(yīng)溫度

按照1.2.4.4設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖5。

圖5 顯色溫度的影響Fig.5 Effectof reaction temperature

分析可知，火棘提取液與AlCl3顯色反應(yīng)后溶液的吸光度隨著反應(yīng)溫度的增加先快速增加，后增幅漸緩，在30℃時(shí)吸光度值達(dá)到最大，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，吸光度快速降低。因此選擇顯色溫度30℃較合適。

2.3.5 體系pH

按照1.2.4.5設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖6。

圖6 醋酸-醋酸鈉緩沖體系pH的影響Fig.6 Effectof pH of HAc-NaAc buffer system

分析可知，火棘提取液與AlCl3顯色反應(yīng)后溶液的吸光度值隨著體系pH的增加先快速增加，在pH= 5.4時(shí)吸光度值達(dá)到最大，此后，隨pH增加，吸光度值緩慢下降，且空白對照液顏色發(fā)生改變，因此在保證較高的測試靈敏度及空白對照液顏色不發(fā)生改變的情況下，體系pH選定為5.4較合適。

2.3.6 緩沖液用量

按照1.2.4.6設(shè)計(jì)，結(jié)果見圖7。

圖7 緩沖液用量的影響Fig.7 Effectof dosageofHAc-NaAc buffer system

分析可知，火棘提取液與AlCl3顯色反應(yīng)后溶液的吸光度值隨著緩沖液用量的增加先快速增加，在2mL時(shí)吸光度值達(dá)到最大，后緩慢降低。故選2mL緩沖液較合適。

2.4 測定方法評價(jià)

2.4.1 火棘提取液標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系的建立

按照1.2.5.1設(shè)計(jì)，以吸光度值A(chǔ)與火棘提取液濃度C（mg/m L）作回歸方程為：A=0.050 0C-0.006 2（R2= 0.993 0，n=9）。分析可知火棘提取液濃度在2mg/mL～10mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，這為之后方法評價(jià)待測提取液濃度范圍選擇提供了依據(jù)。

2.4.2 方法重復(fù)性考察

按照1.2.5.2設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，此測定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.000 9和0.000 3，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.188 4%和0.293 8%，重復(fù)性很好。

2.4.3 方法穩(wěn)定性考察

按照1.2.5.3設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table1 Repeatability testof thedeterm ination results

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Stability testsof the determ ination results

由表2可知，此測定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.000 2和0.000 7，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.014 9%和0.684 9%，因此在溶液顯色反應(yīng)120min以內(nèi)，此測定方法均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。

2.4.4 方法重現(xiàn)性考察

按照1.2.5.4設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，此測定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.003和0.001，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.630 2%和0.961 5%，因此該方法重現(xiàn)性好。

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 3 Reproducibility testsof the determ ination results

2.4.5 回收率考察

按照1.2.5.5設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 總黃酮回收率Table 4 Recovery testsof total flavonoids

由表4可知，該方法測定總黃酮的回收率為100.13%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.016 6%。說明采用該方法用于測定火棘總黃酮具有較高的回收率，精密度良好。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用AlCl3顯色法測定了火棘提取液中總黃酮的含量，分別考察了對照品、顯色劑濃度及用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間、體系pH、緩沖液用量等因素對AlCl3顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，AlCl3顯色法測定火棘提取物中總黃酮含量的最適條件為：1mL適宜濃度的火棘提取液，加入1mL質(zhì)量濃度2%AlCl3，2mL pH5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，70%乙醇定容至10 m L并混勻，不避光條件下30℃顯色反應(yīng)12min后，以蘆丁為對照品，于波長285 nm處測定吸光度。該測定方法具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，回收率較高。

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Systematic Investigation on AlCl3Colorimetric Determ ination of Total Flavonoids from Pyracantha Fortuneana Fruit

YANYou-yu1，2，XIA Ting2，ZHANGYu2，YOUYuan2，ZHAOChun-fang1，YULong-jiang1，*
（1.Schoolof Life Science&Technology，HuazhongUniversityof Science&Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；2.Schoolof Biological&PharmaceuticalEngineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Rutin was taken as reference substance and the optimal condition of aluminum chloride colorimetric assay affecting the determination of total flavonoids from Pyracantha fortuneana extractwasestablished.Several parameters，such as the standard substance，light，reaction time and temperature，concentration and the amount of chromogenic agent，pH and buffer dosage that affecting the color reaction of total flavonoids were investigated systematically.The results indicated the appropriate reaction conditionswere as the following：2mL 2%（m/m）Aluminum chloride was added to 1 m L pyracantha extractwith specific concentration，after being blended the reactionwascarried outat30℃for12min，then absorbancewasmeasured at285 nm.Asa result，Statisticalanalysisshowed themethod had good repeatability，stability，reproducibilityand high recovery rate.

Pyracantha Fortuneana；total flavonoids；rutin；aluminum chloride colorimetricmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.023

2014-09-20

鄢又玉（1975—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然藥物。

*通信作者