口服維生素D對實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠樹突狀細(xì)胞的影響

楊志蕃， 龐 維， 郁春云， 呂衍民， 曹雅明*

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

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口服維生素D對實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠樹突狀細(xì)胞的影響

楊志蕃1， 龐 維2， 郁春云2， 呂衍民2， 曹雅明2*

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

維生素D(VD)為固醇類衍生物，除發(fā)揮抗佝僂病作用，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。主要研究VD對實(shí)驗(yàn)性腦瘧小鼠樹突狀細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，在伯氏瘧原蟲(P.bANKA)感染前給予VD，可降低C57BL/6小鼠發(fā)生腦型瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)，存活時(shí)間明顯延長。VD預(yù)處理后，脾臟中髓樣樹突狀細(xì)胞(CD11c+CD11b+)和漿樣樹突狀細(xì)胞(CD11c+B220+)百分率明顯降低，CD11c+MHCII+細(xì)胞、CD11c+TLR4+細(xì)胞和CD11c+TLR9+細(xì)胞的百分含量也顯著減少。由此提示，預(yù)防性口服VD可抑制感染小鼠樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和功能，對腦型瘧疾的發(fā)生具有一定預(yù)防作用，為新型抗瘧藥物的研發(fā)提供參考。

腦型瘧疾；維生素D(VD)；免疫調(diào)節(jié)；樹突狀細(xì)胞

腦型瘧疾，簡稱腦瘧(Cerebral malaria，CM)是惡性瘧原蟲感染引起的嚴(yán)重綜合癥，是瘧疾患者發(fā)生死亡的主要原因，而且多發(fā)于5歲以下的兒童[1]。目前認(rèn)為腦瘧的發(fā)生與患者體內(nèi)前炎性和抗炎性細(xì)胞因子失衡密切相關(guān)[2-3]。通過建立瘧原蟲感染小鼠模型，也已經(jīng)證實(shí)過度的Th1型前炎癥應(yīng)答是造成感染伯氏瘧原蟲的C57BL/6小鼠發(fā)生死亡的主要原因[4]。維生素D(VD)是一種脂溶性類固醇激素，長期以來被用于抗佝僂病的預(yù)防與治療。但近年來發(fā)現(xiàn)VD對多種疾病具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，包括自身免疫性疾病[5]、心血管疾病[6]、感染性疾病和癌癥[7]等。VD對樹突狀細(xì)胞[8]、Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生具有一定抑制作用，可以誘導(dǎo)Th1和Th17細(xì)胞向Th2型細(xì)胞極化[9]。此外，VD還可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的表達(dá)[10]。VD雖然具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于它對瘧疾的作用相關(guān)報(bào)道尚少。為進(jìn)一步評估VD在腦瘧發(fā)病中的作用，本研究利用伯氏瘧原蟲感染C57BL/6小鼠建立腦瘧模型，在感染前通過口服預(yù)防給予VD，檢測VD對腦瘧的影響和其對樹突狀細(xì)胞(DCs)的作用，以期為新型抗瘧藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 瘧原蟲及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染

6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，經(jīng)腹腔感染1×106個(gè)P.bANKA (日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng))寄生的紅細(xì)胞(pRBC)。感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率、每日監(jiān)測感染小鼠的死亡率和CM相關(guān)的神經(jīng)體征：麻痹、抽搐、昏迷、共濟(jì)失調(diào)或偏癱。

1.2 VD治療

VD (1,25-二羥基維生素D3) 購自Sigma-Aldrich公司，使用前溶解于豆油。實(shí)驗(yàn)組小鼠在感染前口服給VD 50 μg/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d，最后給藥當(dāng)天感染小鼠；對照組在相同的時(shí)間點(diǎn)給予同樣體積的豆油。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，檢測脾臟樹突狀細(xì)胞亞群(mDCs和pDCs)，MHCⅡ、TLR4和TLR9的表達(dá)。應(yīng)用的抗體包括：FITC-抗-CD11c、PE-抗-CD11b、PerCP-抗-B220、PE-抗-MHC II、PE-抗-TLR4、生物素標(biāo)記-抗-TLR9和PE-抗-生物素。其中，TLR9需透膜染色，為間接標(biāo)記；其余均為直接標(biāo)記表面染色。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,單因素方差分析比較各組均值顯著性差異,P< 0.05差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 VD預(yù)處理對腦瘧小鼠原蟲血癥水平和生存率的影響

感染P.bANKA的C57BL/6小鼠在感染后原蟲血癥水平增加，于感染后 11 d以前全部死于腦瘧。CM的特征性體征包括呼吸急促、抽搐、毛發(fā)豎起、痙攣等。而VD預(yù)處理組小鼠的生存期明顯延長，感染過程中無腦瘧癥狀出現(xiàn)，在感染后第16～19天小鼠死于貧血(圖1)。由此表明預(yù)防性給予VD對腦瘧小鼠具有顯著的保護(hù)作用。

圖1 P.b ANKA感染后不同時(shí)間的原蟲血癥水平(A)和生存率(B)Fig.1 The parasitemia(A) and survival rate (B) at different time points after P.b ANKA infection# 與感染對照組比較，P<0.05# P<0.05 VD group vs control group

2.2 預(yù)防給予VD對腦瘧小鼠DCs亞群的影響

DCs是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞[11-12]，是連接固有性與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測了P.bANKA感染C57BL/6小鼠中DCs亞群的變化。結(jié)果顯示，感染后小鼠脾中髓樣DCs(CD11c+CD11b+，mDCs)和漿樣DCs(CD11c+B220+，pDCs)細(xì)胞亞群均明顯增加，顯示DCs在識別抗原后發(fā)生增殖。在感染后第5天和第8天，VD預(yù)處理組中mDCs(圖2A)和pDCs(圖2B)在脾臟中的百分率均明顯低于對照感染組。表明預(yù)先給予VD可抑制脾中DCs亞群的增殖。

圖2 C57BL/6小鼠脾中mDCs(A)和pDCs(B)的百分含量Fig.1 The percentages of mDCs (A) and pDCs (B) in spleen of C57BL/6 mice* 、**與正常對照(0 d)比較，P<0.05、P<0.01；#、##與對照感染組比較，P<0.05、P<0.01* and ** P<0.05 and P<0.01vs pre-infection (0 d) ; # and ## P<0.05 and P<0.01 VD group vs Control group

2.3 預(yù)防給予VD對腦瘧小鼠DCs表達(dá)分子的影響

為進(jìn)一步探討預(yù)先給予VD是否能夠抑制DCs活化，將對照組和VD預(yù)處理組DCs表達(dá)的重要分子MHCII、TLR4和TLR9進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組CD11c+MHCII+細(xì)胞百分含量在感染后第5天和第8天增加明顯，而VD預(yù)處理組CD11c+MHCII+細(xì)胞百分含量低于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 3A)。此外，感染后第8天對照組DCs表達(dá)的TLR4(圖 3B)和TLR9(圖 3C)均顯著增加。與對照組相比，VD預(yù)處理組在感染后第8天DCs的TLR4和TLR9的表達(dá)量明顯低于對照組。這些結(jié)果表明，C57BL / 6小鼠感染P.bANKA的過程中預(yù)先給予VD可顯著抑制DCs的成熟和活化。

圖3 C57BL/6小鼠脾中CD11c+MHCII+(A)、CD11c+TLR4+(B)和CD11c+TLR9+(C)細(xì)胞的百分含量Fig.3 The percentages of CD11c+MHCII+(A), CD11c+TLR4+(B)and CD11c+TLR9+(C)cells in spleen of C57BL/6 mice* 、**與正常對照(0 d)比較，P<0.05、P<0.01；# 與對照感染組比較，P<0.05 * and ** P<0.05 and P<0.01vs pre-infection (0 d); # P<0.05 VD group vs Control group

3 討 論

據(jù)報(bào)道，VD在多種疾病模型中具有一定免疫調(diào)節(jié)作用，本研究發(fā)現(xiàn)在P.bANKA感染前給予C57BL/6小鼠VD，可抑制感染小鼠的DCs的數(shù)量和功能，對腦瘧的發(fā)生具有明顯的預(yù)防作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，P.bANKA感染C57BL/6小鼠后，脾中Th1細(xì)胞百分含量明顯增加，前炎性因子，如IFN-γ、TNF-α和NO也升高顯著。而過強(qiáng)的炎癥應(yīng)答(Th1免疫應(yīng)答)是導(dǎo)致腦瘧發(fā)生的重要原因。預(yù)先給予小鼠VD后，可降低感染小鼠的Th1型免疫應(yīng)答，從而一定程度上阻止腦瘧的發(fā)生[13]。Th1細(xì)胞是適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要角色，其活化需要抗原提呈細(xì)胞的輔助才可完成。DCs是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，能夠有效地刺激初始T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞。發(fā)生瘧疾感染后，DCs攝取瘧原蟲感染的紅細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，主要是誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答以及促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外，通過VD處理人的DCs，可降低其共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，這些與未成熟DCs表型相關(guān)。VD也可以影響DCs的成熟[15-16]。我們的結(jié)果表明，VD預(yù)處理后，P.bANKA感染小鼠的mDCs 和pDCs的數(shù)量顯著降低，同時(shí)其抗原提呈相關(guān)分子(如MHC II)的表達(dá)也下降。由此提示VD預(yù)處理可以顯著抑制DCs的成熟和活化。

近年來，Toll樣受體在瘧疾感染中的作用越來越受到重視。對瘧疾患者的研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體與前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有密切關(guān)系[17]。對TLR9缺陷型小鼠的早期研究顯示，TLR9不僅促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)也誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和B細(xì)胞增殖[18]。TLR4在瘧原蟲感染過程中也具有重要作用。TLR4首先可以識別惡性瘧原蟲糖基化磷脂酰肌醇，同樣能夠誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，活化的TLR4和TLR9可以誘導(dǎo)DCs的成熟并調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，感染前給予小鼠VD可以明顯降低CD11c+DCs上TLR4和TLR9的表達(dá)水平，這可能與我們前期實(shí)驗(yàn)中前炎癥細(xì)胞因子的降低密切相關(guān)。

綜上所述，防止過度的Th1型免疫應(yīng)答是預(yù)防和治療腦瘧的關(guān)鍵。我們的研究表明，感染前預(yù)防性給予VD，可抑制DCs的成熟、活化及抗原識別受體TLR4和TLR9的表達(dá)，從而影響Th1型免疫應(yīng)答和前炎癥因子的產(chǎn)生，有效控制免疫病理損傷，對腦型瘧疾具有有效的預(yù)防和治療作用。這為進(jìn)一步抗瘧新藥的研究與開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

[1] Walton E,Oliveros HVillamor E.Hemoglobin concentration and parasitemia on hospital admission predict risk of multiple organ dysfunction syndrome among adults with malaria[J]. Am J Trop Med Hyg, 2014, 91(1):50-53.

[2] Belnoue E, Kayibanda M, Vigario A M, et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+T cells in experimental cerebral malaria[J]. J Immunol, 2002, 169(11):6369-6375.

[3] Franke-Fayard B, Janse C J, Cunha-Rodrigues M, et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(32):11468-11473.

[4] Mitchell A J, Hansen A M, Hee L, et al. Early cytokine production is associated with protection from murine cerebral malaria[J]. Infect Immun, 2005, 73(9):5645-5653.

[5] Hiraki L T, Munger K L, Costenbader K H, et al. Dietary intake of vitamin D during adolescence and risk of adult-onset systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Care Res (Hoboken), 2012, 64(12):1829-1836.

[6] Van der Schueren B J, Verstuyf AMathieu C. Straight from D-Heart: vitamin D status and cardiovascular disease[J]. Curr Opin Lipidol, 2012, 23(1):17-23.

[7] Herr C, Greulich T, Koczulla R A, et al. The role of vitamin D in pulmonary disease: COPD, asthma, infection, and cancer[J]. Respir Res, 2011, 12(1):31.

[8] Xu H, Soruri A, Gieseler R K, et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 exerts opposing effects to IL-4 on MHC class-II antigen expression, accessory activity, and phagocytosis of human monocytes[J]. Scand J Immunol, 1993, 38(6):535-540.

[9] Giulietti A, van Etten E, Overbergh L, et al. Monocytes from type 2 diabetic patients have a pro-inflammatory profile. 1,25-Dihydroxyvitamin D(3) works as anti-inflammatory[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2007, 77(1):47-57.

[10]Jeffery L E, Burke F, Mura M, et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and IL-2 combine to inhibit T cell production of inflammatory cytokines and promote development of regulatory T cells expressing CTLA-4 and FoxP3[J]. J Immunol, 2009, 183(9):5458-5467.

[11]Banchereau JSteinman R M. Dendritic cells and the control of immunity[J]. Nature, 1998, 392(6673):245-252.

[12]Wilson N SVilladangos J A. Regulation of antigen presentation and cross-presentation in the dendritic cell network: facts, hypothesis, and immunological implications[J]. Adv Immunol, 2005, 86:241-305.

[13]朱曉彤, 馮永輝, 曹雅明, 等. 預(yù)防性給予維生素D對實(shí)驗(yàn)性腦瘧前炎癥應(yīng)答的影響[J]. 微生物學(xué)雜志, 2014, 34(3):66-70.

[14]Grau G E, Frei K, Piguet P F, et al. Interleukin 6 production in experimental cerebral malaria: modulation by anticytokine antibodies and possible role in hypergammaglobulinemia[J]. J Exp Med, 1990, 172(5):1505-1508.

[15]Voisine C, Mastelic B, Sponaas A M, et al. Classical CD11c+dendritic cells, not plasmacytoid dendritic cells, induce T cell responses to Plasmodium chabaudi malaria[J]. Int J Parasitol, 2010, 40(6):711-719.

[16]Takeda M, Yamashita T, Sasaki N, et al. Oral administration of an active form of vitamin D3 (calcitriol) decreases atherosclerosis in mice by inducing regulatory T cells and immature dendritic cells with tolerogenic functions[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(12):2495-2503.

[17]Arama C, Giusti P, Bostrom S, et al. Interethnic differences in antigen-presenting cell activation and TLR responses in Malian children during Plasmodium falciparum malaria[J]. PLoS One, 2011, 6(3):e18319.

[18]Iwasaki AMedzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses[J]. Nat Immunol, 2004, 5(10):987-995.

[19]Coban C, Ishii K J, Kawai T, et al. Toll-like receptor 9 mediates innate immune activation by the malaria pigment hemozoin[J]. J Exp Med, 2005, 201(1):19-25.

Effects of Pre-Treatment with Vitamin D on Dendritic Cells In Experimental Cerebral Malaria Mouse

YANG Zhi-fan1, PANG Wei2, YU Chun-yun2, Lü Yan-min2, CAO Ya-ming2

(1.Dept.ofNephrol.,GeneralHosp.ofShenyangMil.Reg.,Shenyang110016;2.Dept.ofImmunol.,Coll.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

Vitamin D (VD) is the steroid derivatives, it has the effect of anti-rickets, besides a certain immune function. The main immunomodulatory effects and mechanisms of VD on experimental cerebral malaria mouse were studied. The results showed that, as compared with control group, the C57BL / 6 mice that administered VD prior toP.bergheiANKA (P.bANKA) infection, could prevent from cerebral malaria and the survival time was significantly prolonged. The percentages of myeloid dendritic cells (CD11c+CD11b+cells) and plasmacytoid dendritic cells (CD11c+B220+cells) in spleen were significantly reduced after pretreatment of VD. While the percentages of CD11c+MHCII+cells, CD11c+TLR4+cells and CD11c+TLR9+cells in spleen were also decreased obviously. Thereby suggested that preventively oral VD could inhibit the number and function of dendritic cells, and had a preventive effect for cerebral malaria mice in C57BL / 6 infectedP.bANKA. This provided a theoretical basis for the research and development of new anti-malarial medicines.

cerebral malaria; vitamin D; immunoregulation; dendritic cells

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20112104110018)

楊志蕃 男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。主要從事抗感染免疫研究工作。E-mail:yangzhifan@hotmail.com

* 通訊作者。男，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師。主要從事抗感染免疫研究工作。E-mail:ymcao@mail.cmu.edu.cn

2015-11-24；

2015-12-16

Q939.93；R254.5

A

1005-7021(2015)06-0074-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.014