花椒多酚類化合物對卵巢摘除模型小鼠的抗抑郁作用

陳松芳，李立峰，陳靜，王小同，黃漢津

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經內科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

花椒多酚類化合物對卵巢摘除模型小鼠的抗抑郁作用

陳松芳，李立峰，陳靜，王小同，黃漢津

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經內科，浙江 溫州 325027）

目的：探討花椒多酚類化合物總提取物（ZPPC）對卵巢摘除模擬更年期的雌性ICR模型小鼠的抗抑郁作用及可能機制。方法：采用經典的行為絕望抗抑郁模型，即小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗。觀察ZPPC對應激小鼠絕望不動時間的影響；同時觀察ZPPC對小鼠自主活動的影響。采用熒光分光光度法測定ZPPC對小鼠腦內單胺氧化酶活性的影響。結果：與OVX組相比較，ZPPC（50、100、200 mg/kg）明顯縮短小鼠懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間，其作用類似于陽性對照藥氟西?。?0 mg/kg）；ZPPC還明顯抑制腦內單胺氧化酶的活性。結論：ZPPC預給藥在更年期小鼠行為絕望模型中顯示出抗抑郁作用，其機制可能與抑制腦內單胺氧化酶活性有關。

花椒多酚類化合物；更年期抑郁；強迫游泳實驗；單胺氧化酶活性

抑郁癥是一種復雜的心境障礙性疾病，目前全世界約有12%～15%的人罹患本病[1]。研究發(fā)現(xiàn)更年期人群中抑郁癥的發(fā)病率高達20%，占更年期綜合征的78%，其主要的社會功能明顯受到影響，并且圍絕經期的婦女該癥狀的發(fā)生率及自殺率比同年齡的男性要高[2-3]。

目前關于抑郁癥的發(fā)病機制，認為單胺類神經遞質（5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺神經）在抑郁癥的病因病理學中起著非常關鍵的作用，并在臨床的抗抑郁藥物治療中得到了驗證[4-5]。目前臨床上使用的抗抑郁藥一般是通過抑制單胺的代謝及單胺遞質的重吸收而發(fā)揮其作用。但許多藥物起效慢、不良反應明顯。因此，從天然藥物植物中開發(fā)出更具安全性、有效性、不良反應小的抗抑郁藥逐漸成為這一領域的主要研究方向[6-7]。

花椒為蕓香科植物（Zanthoxylum schinifolium Sieb）的成熟干燥果皮，其主要化學成分包括生物堿、酰胺、木脂素等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)多種多酚類化合物，如小補心湯總黃酮多酚類[9]、姜黃素[10]等具有很好的抗抑郁作用。而花椒多酚類化合物總提取物（ZPPC）對更年期抑郁行為的影響鮮見報道。本實驗建立卵巢摘除更年期模型，通過行為絕望抑郁動物的行為學改變及單胺氧化酶活性的影響，評估和篩查該藥物的抗抑郁作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：本實驗采用的是健康雌性ICR小鼠（由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量22～26 g，平均（24±1）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。所有動物適應環(huán)境3 d后進行手術，術前禁食水2～3 h。

1.1.2 藥物：實驗所用花椒購自四川九襄，經粉碎浸提（丙酮-水溶液7∶3）后，減壓去除丙酮，再過濾殘留的水分，經醋酸乙酯萃取分離，脫水烘干，即可得到黃棕色粉末狀產物，即為ZPPC（獲得率為0.033%），每次實驗前需用雙蒸水配成所需要濃度。氟西汀分散片（蘇州禮來制藥有限公司，規(guī)格為每粒0.02 g）。

1.1.3 實驗儀器：DigBehv動物行為分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）、超純水機：850EB超純水系統(tǒng)（Millipore）、550型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）、R-5000熒光分光光度計（日本島津公司）、BIO-RAD全自動酶標儀550型（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：以隨機法將48只雌性ICR小鼠分成假手術組（1組）、雙側卵巢切除（OVX）組（2組）、OVX+ZPPC 50 mg/kg組（3組）、OVX+ZPPC 100 mg/ kg組（4組）、OVX+ZPPC 200 mg/kg組（5組）、OVX+氟西汀10 mg/kg組（6組），每組8只，將以上動物飼養(yǎng)在本實驗動物飼養(yǎng)中心，自由獲得飲水及食物，定期換墊料。

1.2.2 卵巢摘除術：所有動物在適應環(huán)境3 d后進行雙側卵巢手術摘除。卵巢摘除術：10%的水合氯醛腹腔麻醉小鼠（5 mL/kg），取俯臥位皮潔后乙醇棉球消毒背部皮膚，在小鼠大腿根部稍上方水平，脊柱側方不到1 cm處用眼科剪剪開一個與脊柱平行的長約5 mm皮膚切口，仔細剪開下方腰肌，仔細尋找包繞卵巢的脂肪組織見到粉紅色的卵巢后將其拉出切口，在卵巢兩側結扎并摘除卵巢。假手術組不切除卵巢，僅摘取旁邊少許脂肪組織。

1.2.3 小鼠陰道上皮角化實驗：術后1周開始進行陰道上皮角化實驗，其具體操作方法如下：左手抓住小鼠頸背部皮毛，右手持蘸有0.9%氯化鈉溶液棉簽，輕輕插入小鼠陰道，慢慢旋轉，取出涂在載玻片上，以美蘭溶液染色10 min，吹干后在顯微鏡下行細胞學觀察，連續(xù)5 d未觀察到角化細胞或僅有少量的角化細胞則表示去卵巢成功。陰道脫落細胞主要有3種，即白細胞、有核上皮細胞和角化細胞。當小鼠處于動情前期，涂片上絕大部分都是有核上皮細胞，基本很少見到角化細胞；隨后卵泡的慢慢生長成熟，有核上皮細胞轉化為無核角化細胞，表示進入動情期，此時在顯微鏡下觀察時，可以看到幾乎都是無核角化細胞以及很少的上皮細胞；最后在視野中可以發(fā)現(xiàn)白細胞，而無核角化細胞慢慢減少，此時3種細胞同時存在，說明已經進入動情后期。

1.2.4 給藥方式：小鼠在手術恢復2周后開始按每日ZPPC 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg及鹽酸氟西汀10 mg/kg灌胃給藥，對照組則給與同等體積的0.9%氯化鈉溶液，所有組別的動物每天早上8∶00-11∶00給藥1次，連續(xù)給藥2周，末次給藥1 h后對各組小鼠進行強迫游泳實驗、懸尾實驗和自主活動的測試。

1.2.5 小鼠強迫游泳實驗：按Porsolt等[11]創(chuàng)建的方法，稍加改進。末次給藥后1 h，將小鼠置于水溫（25±1）℃、水深15 cm的游泳桶中游泳6 min，先適應2 min，記錄后4 min小鼠累計的不動時間。小鼠被放進游泳桶中后會出現(xiàn)掙扎試圖攀爬的行為，一段時間后便因失望而漂浮不動，當小鼠停止掙扎，浮在水中保持不動時開始記錄，記錄其累積不動時間。

1.2.6 小鼠懸尾實驗：按Steru等[12]建立的方法，略加改進。末次給藥后1 h，分別將小鼠尾部2 cm處的部分固定于自制的懸尾支架上，使小鼠處于懸掛狀態(tài)，其頭部離臺面5 cm，小鼠倒掛時間為6 min，除去先適應的2 min，記錄其后4 min的累積不動時間。當小鼠被倒掛于懸尾支架上后，小鼠頭部開始上下左右活動，企圖找到攀爬的地方，一段時間后因失望而活動次數減少，即出現(xiàn)間斷性不動，記錄其累積不動時間。

1.2.7 自主活動測試：將小鼠置于正方形開野實驗箱為80 cm×80 cm×75 cm，底板用筆畫成10 cm× 10 cm的方格。室內隔音，用視頻記錄小鼠活動行為，每只小鼠測試時間10 min，測試完成后用DigBehv動物行為分析系統(tǒng)進行測試結果分析。

1.2.8 小鼠腦內單胺氧化酶活性測定：完成上述實驗后將小鼠立刻頸椎脫臼處死，斷頭取腦，在冰盤上分離腦組織，稱質量后保存在-80 ℃冰箱中待行腦內單胺氧化酶活性測定。進行單胺氧化酶活性測定時，先把腦組織室溫下解凍，在解凍后的腦組織中加入pH為7.8、濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖液4 mL，制成勻漿液；取0.2 mL組織勻漿液，在勻漿液中加入20%的曲通0.4 mL混合；再把上述混合液加入到2.5 mL的磷酸緩沖液中，溶液混勻后在38 ℃水箱中預孵育10 min，在反應液中加入30μL濃度為2.19 mmol/L底物（終濃度為22μmol/L），37℃水箱中預孵育30 min，在反應液中加入0.2 mL濃度為5 mol/L高氯酸溶液，冷卻并離心（1 500×g，10 min），在0.5 mL上清液中加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液2.5 mL。通過熒光分光光度計在激發(fā)光318 nm、發(fā)射光380 nm處測定產物4-氫喹啉的熒光強度。單胺氧化酶活性以nmol·30 min-1·mg protein-1表示。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 所有數據采用SPSS16.0軟件包進行分析。多個樣本間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ZPPC對小鼠強迫游泳實驗的影響 OVX+氟西汀10 mg/kg組及花椒多酚類化合物50、100、200 mg/kg 3個劑量組均能不同程度地縮短小鼠強迫游泳累積不動時間，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A。與OVX組（2組）比較，其中OVX+ZPPC 50 mg/kg組（3組）、OVX+ZPPC 100 mg/kg組（4組）、OVX+ZPPC 200 mg/kg組（5組），分別縮短了9.15%、28.10%、35.94%，花椒多酚類化合物劑量與小鼠強迫游泳累積不動時間存在顯著的負相關，有統(tǒng)計學意義（R=-0.951，P＜0.05），見圖1B。

2.2 ZPPC對小鼠懸尾實驗的影響 OVX+氟西汀10 mg/kg組、花椒多酚類化合物50、100、200 mg/kg 3個劑量給藥均能明顯縮短小鼠懸尾實驗累積不動時間，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2A。同樣，花椒多酚類化合物劑量與小鼠懸尾實驗累積不動時間存在顯著的負相關，有統(tǒng)計學意義（R= -0.989，P＜0.05），見圖2B。

圖1 ZPPC對小鼠強迫游泳實驗的影響

圖2 ZPPC對小鼠懸尾實驗的影響

2.3 ZPPC對小鼠自發(fā)活動總路程的影響 發(fā)現(xiàn)給予花椒多酚類化合物50、100、200 mg/kg 3個劑量時，小鼠的運動總路程與空白組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.5），見表1。

2.4 ZPPC對小鼠腦內單胺氧化酶含量的影響 OVX+氟西汀10 mg/kg組和花椒多酚類化合物50、100、200 mg/kg 3個劑量對照組均顯示小鼠腦內的單胺氧化酶的活性受到不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A。進一步的相關性分析顯示，兩者的相關性無統(tǒng)計學意義（R=-0.942，P=0.058），見圖3B。

表1 ZPPC對小鼠自發(fā)活動總路程的影響（n=8，±s，cm）

表1 ZPPC對小鼠自發(fā)活動總路程的影響（n=8，±s，cm）

組別 自發(fā)活動總路程假手術組 1 350.123±761.12 OVX組 1 454.430±754.25 OVX+ZPPC 50 mg/kg組 1 239.682±656.36 OVX+ZPPC 100 mg/kg組 1 682.488±692.28 OVX+ZPPC 200 mg/kg組 1 641.375±739.45 OVX+10 mg/kg氟西汀組 1 478.842±683.75

圖3 ZPPC對小鼠腦內單胺氧化酶含量的影響

3 討論

圍絕經期是女性抑郁癥的高發(fā)時期之一[13]。圍絕經期目前為止仍沒有統(tǒng)一的定義及診斷標準，結合公認一些文獻，認為女性卵巢功能逐漸衰退到絕經后1年，故卵巢功能的退化是其前提條件。本實驗以去卵巢建立絕經模型，并采用抗抑郁藥物篩查經典動物模型：強迫游泳實驗及懸尾實驗，以此評估該藥物抗抑郁效應。

強迫游泳實驗是一種簡便、易實施、具有良好信度和效度的抑郁癥動物模型，主要被用來篩選具有潛在抗抑郁活性的藥物[14]。在此模型后，又逐漸衍生出其他的一些行為絕望模型，其中較突出的是Steru等[12]在1985年創(chuàng)建的小鼠懸尾模型，上述模型動物均在開始一段時間“求生式”活動后，因失望而活動次數減少，出現(xiàn)間歇性不動，顯示“絕望狀態(tài)”。不動行為是在模型動物嘗試了主動逃跑，但失敗之后出現(xiàn)的適應性行為，被視為“抑郁狀態(tài)”的指標[14]。

本實驗給予去勢后小鼠不同劑量的花椒多酚類化合物及陽性對照藥物（氟西汀10 mg/kg），觀察記錄小鼠的行為模式和行為時間，來評估藥物的抗抑郁作用。結果發(fā)現(xiàn)OVX組與假手術組比較，強迫游泳及懸尾實驗的累積不動時間均有所增加，可能在手術組中由于切除了卵巢的小鼠雌激素分泌明顯減少，對小鼠的累積不動時間有所影響，顯示去勢小鼠更加容易顯現(xiàn)“絕望狀態(tài)”，此與以往研究[13]相符。而OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg組和OVX+氟西汀10 mg/kg組的強迫游泳及懸尾實驗的累積不動時間有明顯縮短，說明3個不同劑量的ZPPC對小鼠的累積不動時間有不同程度縮短，并在一定劑量范圍內存在相關性。其中ZPPC 200 mg/kg組作用效果與陽性對照藥物相類似。提示ZPPC預給藥具有一定的抗抑郁作用。然而，該作用需排除藥物的假陽性結果，因為不少非抗抑郁的藥物如皮層興奮劑—咖啡因能夠減少動物的不動時間，從而出現(xiàn)假陽性結果。所以在研究抗抑郁藥物過程中，需要觀察小鼠的自發(fā)活動來區(qū)分抗抑郁藥和非抗抑郁藥。本次實驗中，通過DigBehv動物行為分析系統(tǒng)分析小鼠的自發(fā)行為，測量各組小鼠在開放場實驗中的總路程，我們發(fā)現(xiàn)與假手術組及OVX組相比較，OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg組差異均無統(tǒng)計學意義，從而我們可以認為ZPPC對小鼠的自發(fā)行為不存在影響。因此，我們可以排除ZPPC對小鼠強迫游泳及懸尾實驗的假陽性，從而認為它確實存在抗抑郁作用。

關于抑郁癥的發(fā)病機制，主要包括單胺類遞質失調假說、HPA軸過度激活學說、神經可塑性理論以及免疫損傷等各種學說。其中單胺類遞質假說發(fā)展得較為成熟，抑制單胺氧化酶的活性，能夠提高突觸間隙單胺類神經遞質的含量，進而達到抗抑郁的效果[15-16]。隨后又有人員發(fā)現(xiàn)消耗單胺類神經遞質，可導致臨床一部分患者出現(xiàn)抑郁癥狀[17]。單胺假說的核心理念認為神經細胞突出間隙的單胺類神經遞質5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺的相對與絕對不足是抑郁癥發(fā)生的神經生化基礎，也是目前大多數抗抑郁藥的直接作用靶點。

對于更年期抑郁癥的發(fā)生，1994年Schimdt等[18]首次提出了雌激素撤退假說，認為進入更年期的女性，卵巢功能逐漸減退導致雌激素分泌下降，而低雌激素狀態(tài)可以促進抑郁癥的發(fā)生或加重抑郁癥的病情。張巍等[19]在研究更年期婦女抑郁癥狀與性激素關系時也發(fā)現(xiàn)，雌孕激素能夠影響單胺氧化酶的變性和5-羥色胺的代謝，使其濃度發(fā)生改變。對于更年期抑郁癥的發(fā)生，可能與突觸后5-羥色胺的受體功能有密切關系，因為雌孕激素都有調節(jié)5-羥色胺受體表達的功能。隨后的研究[20]發(fā)現(xiàn)，雌激素可以在基因水平上影響中樞神經遞質系統(tǒng)，可以促進神經元的發(fā)育和神經突觸的生長。本研究主要觀察小鼠腦內單胺氧化酶活性的改變，結果發(fā)現(xiàn)：與假手術組比較，OVX組的單胺氧化酶活性有所升高，這可能與上文中提到的雌激素能加速單胺氧化酶的變性有關，與更年期抑郁癥的雌激素撤退假說[18]也相符。另外，OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg組小鼠全腦內單胺氧化酶活性明顯受抑制；因此，我們認為ZPPC預給藥抗抑郁作用可能與抑制小鼠腦內單胺氧化酶活性有關。

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（本文編輯：吳彬）

The antidepressant effect of procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim on ovariectomized model mice

CHEN Songfang,LI Lifeng,CHEN Jing,WANG Xiaotong,HUANG Hanjin.Department of Neu-ology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To explore the antidepressant effect of chronic pre-administration with procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim (ZPPC) on ovariectomized model mice and its possible mechanism.Methods:The animals behavioral despair models of depression,including the tail suspension and forced wimming tests,were used to explore the antidepressant effects of ZPPC.The locomotor activity test was used to detect the change of locomotor activity.Meanwhile,the monoamine oxidase activity in the mouse brain was also determined.Results:The results showed that ZPPC (50,100,200 mg/kg) significantly reduced the duration of mmobility in both tail suspension and forced swimming tests.The effective doses did not alter locomotot activity,esembling the selectivity of the positive control drug fluoxetine (10 mg/kg) in relieving depression.Moreover,ZPPC was found to inhibit monoamine oxidase activity in the mouse brain.Conclusion:These findings suggest hat ZPPC exerts antidepressant effect in animals behavioral despair tests and the underlying mechanism may involve the central monoaminergic systems.

Zanthoxylum bungeanum Maxim; menopausal depression; forced swimming test; monoamine oxidase

R749.4

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.007

2014-11-04

溫州市科技局科技計劃項目（Y20100291）。

陳松芳（1974-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

黃漢津，主任醫(yī)師，Email：hanjinhuang@163.com。