SLC30A8和PTPRD基因多態(tài)性與南京地區(qū)中老年人群2型糖尿病的相關(guān)性研究

趙麗娟 徐寬楓 楊濤 戴皓 馬冰沁 季荔 陳陽(yáng) 施云 鄭帥 胡晴芳張青青 楊帆 蔣琳

·論著·

SLC30A8和PTPRD基因多態(tài)性與南京地區(qū)中老年人群2型糖尿病的相關(guān)性研究

趙麗娟 徐寬楓 楊濤 戴皓 馬冰沁 季荔 陳陽(yáng) 施云 鄭帥 胡晴芳張青青 楊帆 蔣琳

目的 探討溶質(zhì)載體家族 30/鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，成員 8（SLC30A8）基因（rs13266634和rs3802177）和蛋白酪氨酸磷酸酶受體D（PTPRD）基因（rs17584499）單核苷酸多態(tài)性與南京地區(qū)中老年人群2型糖尿病的相關(guān)性。方法 對(duì)南京地區(qū)40歲以上人群行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)及問卷調(diào)查，選取2型糖尿病1 758例（糖尿病組），正常對(duì)照1 970名（對(duì)照組），提取外周血基因組DNA，對(duì)其SLC30A8和PTPRD基因3個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，分析與2型糖尿病的關(guān)系。結(jié)果SLC30A8基因位點(diǎn)rs13266634在糖尿病組的基因型頻率（CC、CT和TT）分別為35.9%、48.2%和15.9%，對(duì)照組為33.3%、48.8%和17.9%，糖尿病組C等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2=3.986，P=0.046），C等位基因攜帶者患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.158倍[優(yōu)勢(shì)比（OR）=1.158，P=0.005]。位點(diǎn)rs3802177在糖尿病組的基因型頻率（CC、CT和TT）分別為35.3%、48.2%和16.5%，對(duì)照組為32.1%、49.9%和18.0%，糖尿病組C等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2=4.085，P=0.043），C等位基因攜帶者患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.162倍（OR=1.162，P=0.004）。PTPRD基因位點(diǎn)rs17584499在糖尿病組的基因型頻率（CC、CT和TT）分別為81.9%、16.9%和1.2%，對(duì)照組為82.4%、16.5%和1.1%，兩組基因頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.274，P=0.600）。結(jié)論 SLC30A8基因位點(diǎn)rs13266634和rs3802177的C等位基因可能是2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)基因，與南京地區(qū)中老年人群2型糖尿病相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)PTPRD基因（rs17584499）與本地區(qū)2型糖尿病相關(guān)。

溶質(zhì)載體家族30/鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，成員8；蛋白酪氨酸磷酸酶受體D；2型糖尿?。粏魏塑账岫鄳B(tài)性

2型糖尿病是一種常見的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)病受遺傳及環(huán)境等多種因素共同影響。自2007年以來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）及薈萃分析發(fā)現(xiàn)了眾多與2型糖尿病相關(guān)的易感基因，如TCF7L2、CDKAL1、HHEX 和 KCNJ11 等[1]。胰島分泌顆粒對(duì)Zn的攝入主要靠鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8（ZnT8）來(lái)調(diào)節(jié)，而ZnT8是溶質(zhì)載體家族30/鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，成員8（SLC30A8）基因的表達(dá)產(chǎn)物[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SLC30A8基因的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與2型糖尿病有關(guān)，但不同研究結(jié)果尚存在差異[3]。且在中國(guó)人群中的大樣本研究為數(shù)不多。蛋白酪氨酸磷酸酶受體 D（PTPRD）基因（rs17584499）是 2010年首先在漢族人群（中國(guó)臺(tái)灣居民）中發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病相關(guān)的[4]。但2013年對(duì)日本人群的研究得出了陰性結(jié)果[5]。目前，此基因位點(diǎn)與中國(guó)大陸人群2型糖尿病發(fā)病的關(guān)系研究甚少。本研究對(duì)南京地區(qū)人群 SLC30A8基因（rs13266634、rs3802177）和 PTPRD基因（rs17584499）進(jìn)行了SNP檢測(cè)和分析，旨在探討其與2型糖尿病的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年中國(guó)非傳染性疾病流行病學(xué)調(diào)查中南京地區(qū)人群，均進(jìn)行過(guò)75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）、HbA1c、血脂水平檢測(cè)及問卷調(diào)查，共1758例2型糖尿病患者入選作為糖尿病組，其中男性753例，女性1 005例，同時(shí)，選擇1 970名正常者作為對(duì)照組，其中男性622名，女性1 348名。

糖尿病組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡在40周歲以上。（2）OGTT結(jié)果符合世界衛(wèi)生組織（1999年）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，并結(jié)合病史及家族史排除1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及其他原因所致糖尿病。（3）既往已確診為2型糖尿病的患者。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡在40周歲以上。（2）OGTT檢測(cè)結(jié)果血糖正常。（3）既往無(wú)任何糖尿病及血糖異常病史。所有使用胰島素治療、既往腫瘤病史、肝臟疾病病史（慢性病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝病、其他肝臟疾?。⒓甭砸认傺撞∈坊颊呔醇{入本研究中。經(jīng)入選人群均知情同意并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 提取外周血基因組DNA 取外周血2 ml，使用DNA提取試劑盒（TIANGEN公司），按照說(shuō)明書的步驟提取基因組DNA：取凍存的抗凝血2 ml，加入蛋白酶K混勻，加入緩沖液GE，混勻后置于65℃水浴，簡(jiǎn)短離心（3 000 r/min，r=160 mm）并室溫冷卻，加入無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移一半上述溶液至吸附柱，離心（5 000 r/min，r=160 mm）后丟棄濾液，將另一半溶液以同樣方法過(guò)濾，向吸附柱中加入緩沖液 GD，離心（5 000 r/min，r=160 mm）后向吸附柱中加入緩沖液PW，離心（5 000 r/min，r=160 mm）后再次向吸附柱中加入緩沖液PW，離心（5 000 r/min，r=160 mm）后將吸附柱放入新的離心管中，加入250μl洗脫液 TB，室溫靜置 5min，離心（5000r/min，r=160 mm）后將洗脫出濾液的吸至吸附柱中，再次靜置后離心（5 000 r/min，r=160 mm），將所得溶液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因和基因分型檢測(cè) 確定SNP位點(diǎn)后，使用Sequenom實(shí)驗(yàn)平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以所選SNP位點(diǎn)為中心截取長(zhǎng)度大于100 bp的基因序列，結(jié)合文獻(xiàn)并采用AssayDesigner3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，繼而合成引物。對(duì)目的基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)SAP純化、單堿基延伸反應(yīng)后去鹽、導(dǎo)入Assay中，并完成樣本表格輸入、建板和點(diǎn)樣后進(jìn)行Mass ARRAY分析，得出基因分型檢測(cè)結(jié)果（北京六合華大基因科技有限公司）。每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型檢出率98%以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)χ2檢驗(yàn)判斷各位點(diǎn)的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。連續(xù)變量的組間比較采用t檢驗(yàn)，分類變量的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，關(guān)聯(lián)性分析采用二元Logistic回歸，用優(yōu)勢(shì)比（OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI）表示相對(duì)危險(xiǎn)度，同時(shí)進(jìn)行性別、年齡及體重指數(shù)的校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡與臨床特征 入選的糖尿病組基本臨床特征如表1～3所示。糖尿病組和對(duì)照組 SLC30A8基因（rs13266634、rs3802177）和 PTPRD基因（rs17584499）的基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。各基因位點(diǎn)糖尿病組與對(duì)照組之間的性別、年齡及體重指數(shù)存在差異，糖尿病組男性比例、年齡及體重指數(shù)均高于對(duì)照組。

2.2 各基因位點(diǎn)與2型糖尿病的相關(guān)性 SLC30A8基因rs13266634位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果得到CC、CT和TT 3種基因型。對(duì)照組3種基因型（CC、CT和TT）的頻率分別為33.3%、48.8%和17.9%，糖尿病組分別為35.9%、48.2%和15.9%，糖尿病組C等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2=3.986，P=0.046），見表 4。經(jīng)年齡、性別及體重指數(shù)校正后，C等位基因攜帶者患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.158倍（OR=1.158，95%CI：1.046～1.283，P=0.005）。在顯性模型和隱性模型中，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

SLC30A8基因rs3802177位點(diǎn)檢測(cè)得到CC、CT和TT3種基因型。對(duì)照組3種基因型（CC、CT和TT）頻率分別為32.1%、49.9%和18.0%，糖尿病組分別為35.3%、48.2%和16.5%，糖尿病組C等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2=4.085，P=0.043），見表 6。經(jīng)校正年齡、性別及體重指數(shù)后，C等位基因攜帶者患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.162倍（OR=1.162，95%CI：1.049～1.288，P=0.004）。在顯性模型中，經(jīng)年齡、性別、體重指數(shù)校正后兩組差異未及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.053），在隱性模型中，兩組比較有顯著性差異（P＜0.01），見表 7。

表1 SLC30A8基因rs13266634位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

表1 SLC30A8基因rs13266634位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

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表2 SLC30A8基因rs3802177位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

表2 SLC30A8基因rs3802177位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

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表3 PTPRD基因rs17584499位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

表3 PTPRD基因rs17584499位點(diǎn)的有效例數(shù)及基本臨床特征（±s）

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表4 SLC30A8基因位點(diǎn)rs13266634基因型分布

表5 SLC30A8基因位點(diǎn)rs13266634與T2DM的相關(guān)性

表6 SLC30A8基因位點(diǎn)rs3802177基因型分布

表7 SLC30A8基因位點(diǎn)rs3802177與T2DM的相關(guān)性

表8 PTPRD基因位點(diǎn)rs17584499基因型分布

PTPRD基因rs17584499位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果得到CC、CT和TT3種基因型。糖尿病組3種基因型（CC、CT和TT）頻率分別為81.9%、16.9%和1.2%，對(duì)照組分別為82.4%、16.5%和1.1%，兩組等位基因頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.274，P=0.600），見表 8。經(jīng)校正年齡、性別及體重指數(shù)后，兩組基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在顯性模型和隱性模型中，兩組比較差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表9。

表9 PTPRD基因位點(diǎn)rs17584499與T2DM的相關(guān)性

3 討論

SLC30A8基因位于8號(hào)染色體，主要在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為ZnT8，可向胰島素分泌顆粒中攝取鋅，鋅離子與胰島素和鈣離子結(jié)合形成穩(wěn)定的胰島素晶體，然后被分泌入血，后晶體穩(wěn)定性受到破壞，釋放出胰島素單體、游離鋅離子和鈣離子，鋅離子可被ZnT8再攝取入胰島β細(xì)胞漿中進(jìn)一步利用，故該基因的表達(dá)產(chǎn)物ZnT8與胰島素分泌顆粒的合成及分泌有關(guān)[1-2]。自SLC30A8基因被發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病相關(guān)后，其在不同種族及地區(qū)人群中的進(jìn)一步研究結(jié)果存在差異[3]。本研究結(jié)果表明，SLC30A8基因rs13266634和rs3802177與南京地區(qū)2型糖尿病發(fā)病存在相關(guān)性，其C等位基因可能增加2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

SLC30A8基因的編碼序列外顯子13可編碼ZnT8的最后52個(gè)氨基酸，rs13266634和rs3802177為該外顯子內(nèi)的SNP位點(diǎn)，其中rs13266634的次要等位基因T可使325位的精氨酸轉(zhuǎn)換為色氨酸[2]。GWAS研究數(shù)據(jù)和本研究結(jié)果顯示，SLC30A8基因rs13266634的主要等位基因與人群2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，故有假設(shè)認(rèn)為其編碼的改變可能直接影響ZnT8對(duì)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)。Nicolson等[6]研究證實(shí)，ZnT8色氨酸突變的小鼠MIN6細(xì)胞質(zhì)中鋅濃度高于精氨酸突變的細(xì)胞，故認(rèn)為色氨酸突變可能使ZnT8的轉(zhuǎn)運(yùn)活性增加，但這種變化是如何影響β細(xì)胞功能的，目前尚不清楚，因?yàn)镃auchi等[7]發(fā)現(xiàn)色氨酸突變與基礎(chǔ)胰島素和葡萄糖刺激的胰島素分泌的改善均不相關(guān)。另外，Maruthur等[8]研究表明，給健康人群補(bǔ)充外源性鋅劑（醋酸鋅）后，可觀察到葡萄糖刺激的早相胰島素分泌增加，且其增加幅度因SLC30A8基因rs13266634基因型的不同而存在差異，可能與ZnT8的表達(dá)差異有關(guān)。

PTPRD基因位于9號(hào)染色體上，其編碼產(chǎn)物為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，此種酶包括細(xì)胞外區(qū)域、跨膜片段和胞質(zhì)內(nèi)的催化片段，由此組成受體結(jié)構(gòu)，參與調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、有絲分裂等。2010年關(guān)于中國(guó)臺(tái)灣漢族人群的首個(gè)GWAS研究發(fā)現(xiàn)，PTPRD基因rs17584499的T等位基因與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，可能為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)基因[4]。后有研究報(bào)道，在隨訪5.43年后，攜帶PTPRD基因rs17584499基因型TT的人群發(fā)展為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加，且可能與胰島素抵抗增加有關(guān)[9]。而2013年對(duì)日本人群的研究未發(fā)現(xiàn)PTPRD基因rs17584499與2型糖尿病相關(guān)[5]。本研究亦未發(fā)現(xiàn)PTPRD基因rs17584499與2型糖尿病有關(guān)，其中T等位基因在病例組的基因頻率為0.097，低于日本人群的結(jié)果。

本研究糖尿病組與對(duì)照組之間基本臨床特征存在差異，可能與2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素（性別、年齡和肥胖）有關(guān)，結(jié)果分析中對(duì)兩組之間上述差異進(jìn)行了校正。本研究表明，SLC30A8基因rs13266634和rs3802177的C等位基因與南京地區(qū)中老年人群2型糖尿病發(fā)病存在相關(guān)性，可能為2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)基因，未發(fā)現(xiàn)PTPRD基因（rs17584499）與2型糖尿病發(fā)病有關(guān)。有關(guān)SLC30A8基因多態(tài)性影響2型糖尿病發(fā)病的具體機(jī)制，目前尚不十分清楚，仍需進(jìn)一步探索。

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Relationship between SLC30A8 and PTPRD gene polymorphisms and type 2 diabetes in middle aged and elderly people in Nanjing area

Zhao Lijuan*，Xu Kuanfeng，Yang Tao，Dai Hao，Ma Bingqin，JiLi，ChenYang，ShiYun，ZhengShuai，Hu Qingfang，ZhangQingqing，YangFan，JiangLin.*Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

Jiang Lin，Email：jlinna0000@163.com

ObjectiveTo explore the relationship between solute carrier family 30/zinc transporter，member 8（SLC30A8）gene（rs13266634 and rs3802177） and protein tyrosine phosphatase receptor type D（PTPRD）gene（rs17584499）single nucleotide polymorphisms（SNPs）and type 2 diabetes in middle aged and elderlypeople in Nanjingarea.MethodsGenomic DNAwere extracted fromperipheral blood of1 758 type 2 diabeticpatients（diabetesgroup）and 1 970 healthycontrols（controlgroup）whohad

75 goralglucose tolerance test and questionnaire survey.All patients were all over 40 years old and came from Nanjing area.Genotypes of three target loci of gene SLC30A8 and PTPRD were detected.Relation between type 2 diabetes and genotype distribution were analyzed.ResultsThe frequencies of the three genotypes CC，CT and TT of SLC30A8 rs13266634 were 35.9%，48.2%and 15.9%in diabetes group and 33.3%，48.8%and 17.9%in control group，respectively.The C allele frequency in diabetes group was higher than that in control group（χ2=3.986，P=0.046）.The risk of type 2 diabetes for C allele carriers was 1.158 times that of T allele[odd ratio（OR）=1.158，P=0.005].The frequencies of three genotypes CC，CT and TT of rs3802177 were 35.3%，48.2%and 16.5%in diabetes group and 32.1%，49.9%and 18.0%in control group，respectively.The C allele frequency in diabetes group was higher than that in control group（χ2=4.085，P=0.043）.The risk oftype 2 diabetes for Callele carriers was 1.162 times that of T allele（OR=1.162，P=0.004）.The distribution of CC，CT and TT of PTPRD rs17584499 in control group（81.9%，16.9%and 1.2%）and diabetes group（82.4%，16.5%and1.1%）was not different（χ2=0.274，P=0.600）.ConclusionsThe polymorphisms of rs13266634 and rs3802177 in SLC30A8 are associated with type 2 diabetes in middle aged and elderly people in Nanjing area.The C allele might be a risk allele of type 2 diabetes.There is no relationship between rs17584499 in PTPRDand type 2 diabetes in this area.

Solute carrier family 30/zinc transporter，member 8；Protein tyrosine phosphatase receptor type D；Type 2 diabetes mellitus；Single nucleotide polymorphism

（Int J Endocrinol Metab，2015，35：145-148）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.03.001

210029 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（趙麗娟，徐寬楓，楊濤，戴皓，馬冰沁，季荔，陳陽(yáng)，施云，鄭帥，蔣琳）；215004 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科（胡晴芳）；225499 泰州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（張青青）；214002 無(wú)錫市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（楊帆）

蔣琳，Email：jlinna0000@163.com

2014-12-30）