嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的分子改造及其應(yīng)用*

宿玲恰，張悅，吳敬

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

海藻糖是由兩個(gè)吡喃葡萄糖通過半縮醛羥基縮合，以α-1，1-糖苷鍵連接而成的非還原性二糖，廣泛存在于微生物、植物和昆蟲中［1-3］。海藻糖具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，能夠有效保護(hù)生物膜和生物大分子，從而維持生命體的生命過程和生物特征。2000年7月，Nature中有關(guān)海藻糖評(píng)價(jià)專文提出:“海藻糖的存在與否關(guān)系著很多生命的生存或者死亡”。海藻糖還能夠作為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中生物活性物質(zhì)的優(yōu)良保護(hù)劑和穩(wěn)定劑。因此，海藻糖以其獨(dú)特的理化性質(zhì)和功能在食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、生化制品業(yè)和化妝品業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景［1，4-5］。

在海藻糖的制備方面，人們投入了大量精力對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究，并尋求簡(jiǎn)單有效的生產(chǎn)方式。目前，海藻糖的制備方法主要包括天然生物提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法又分為海藻糖合酶法、磷酸化酶法以及麥芽寡聚糖基海藻糖合成酶和麥芽寡聚糖基海藻糖水解酶雙酶法［6-8］。其中，海藻糖合酶(Trehalose synthase，簡(jiǎn)稱 TreS，EC 5.4.99.16)是一類分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶，能夠催化麥芽糖一步轉(zhuǎn)化為海藻糖，具有成本低廉、轉(zhuǎn)化工藝簡(jiǎn)單和產(chǎn)物易于分離提取等優(yōu)勢(shì)，為目前海藻糖制備方法的研究方向［9-10］。

海藻糖合酶來(lái)源于多種微生物，包括常溫菌和嗜熱菌。通常情況下，常溫菌來(lái)源的酶的最適反應(yīng)溫度為25～35℃，最適pH 6.5～8.0。當(dāng)采用該類酶制備海藻糖時(shí)，由于酶的作用環(huán)境適合于多種微生物生長(zhǎng)，常常易受到雜菌污染，消耗反應(yīng)底物和產(chǎn)物，造成原料浪費(fèi)，同時(shí)使得反應(yīng)體系pH難以控制，影響酶催化活性和穩(wěn)定性。而嗜熱菌來(lái)源的酶的最適溫度一般高于60℃，并且在60～80℃、pH 5.5～9.5條件下仍然保持較好的穩(wěn)定性，因此有利于通過提高酶反應(yīng)溫度減少微生物污染，避免損失［10-13］。

本研究團(tuán)隊(duì)前期研究中克隆表達(dá)了來(lái)源于嗜熱棲熱菌的海藻糖合酶，并優(yōu)化了該酶催化麥芽糖制備海藻糖的酶轉(zhuǎn)化工藝，但轉(zhuǎn)化率僅有49.0%(數(shù)據(jù)將在《基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)》雜志2015年第34卷發(fā)表)。本文通過定點(diǎn)突變，獲得了催化性能提升的海藻糖合酶突變體，為其進(jìn)一步工業(yè)化規(guī)模制備和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、質(zhì)粒 pET24a(+)-TreS為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑

瓊脂糖、Prime STAR? HS DNA聚合酶和DpnI，TaKaRa(大連)公司;質(zhì)粒提取試劑盒，天根(北京)生化科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)，生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白質(zhì)凝膠電泳試劑盒和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，碧云天生物技術(shù)(上海)有限公司;高效液相色譜柱Syncronis Amino Column(4.6 mm ×250 mm)，Thermo Scientific公司(美國(guó));蛋白胨和酵母粉，Oxoid公司(英國(guó));麥芽糖、海藻糖和葡萄糖等分析純?cè)噭瑖?guó)藥集團(tuán)(北京)。

1.3 工程菌的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pET-24a(+)-TreS為模板，通過一步PCR獲得突變體 P251L。正向引物(P251L-F):5＇-ATGTGGCCGGAGGAGACCCTGCCCTACTTCGGGGAC-3＇，反 向 引 物 (P251L-R):5＇-GTCCCCGAAGTAGGGCAGGGTCTCCTCCGGCCACAT-3＇。通過核酸電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用Dpn I降解模板后，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，在LB瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～10 h，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。將含突變正確的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，從而獲得重組表達(dá)海藻糖合酶突變體的基因工程菌。

1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1.4.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10，蛋白胨10，酵母粉5，卡那霉素0.03，pH 7.0。

TB 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12，KH2PO416.4，酵母粉24，K2HPO42.3，甘油5，卡那霉素0.03，pH 7.0。

1.4.2 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng):將保藏于-80℃的甘油管中吸取20 μL菌液接種至含30 μg/mLKan的LB培養(yǎng)基中，于200 r/min、37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8～10 h。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以5%接種量接至含30 μg/mL Kan的 TB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值達(dá)到 1.5，加入終濃度為 0.05 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.5 海藻糖的制備

1.5.1 海藻糖合酶轉(zhuǎn)化條件的研究

用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制一定濃度的麥芽糖底物溶液，取10 mL裝于50 mL具塞三角瓶中，然后加入一定量的酶液，置于水浴搖床中以150 r/min進(jìn)行酶反應(yīng)，定時(shí)取樣，沸水浴10 min，并以12 000 r/min離心10 min后，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，稀釋，利用HPLC檢測(cè)(見1.6.4)反應(yīng)產(chǎn)物中海藻糖的生成量。

1.5.2 海藻糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算(公式1)

1.6 分析方法

1.6.1 大腸桿菌細(xì)胞光密度(OD600值)的測(cè)定

用去離子水作為空白對(duì)照，利用蛋白核酸定量?jī)x測(cè)定經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌液在波長(zhǎng)600 nm下的吸光度值，OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.6.2 細(xì)胞破碎

收集重組菌發(fā)酵液，于12 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，然后加入等體積磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將菌體徹底懸浮。利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞 (工作條件:φ 6工作探頭，時(shí)間15 min，工作3 s間歇2 s，功率25%)，進(jìn)而于12 000 r/min離心15 min，收集上清液即為海藻糖合酶酶液。

1.6.3 海藻糖合酶酶活力測(cè)定

將稀釋一定倍數(shù)的酶液與用磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)配制的0.1 g/mL麥芽糖溶液均勻混合，置于60℃反應(yīng)30 min后，沸水浴15 min將酶滅活以終止反應(yīng)，然后通過HPLC檢測(cè)(見1.6.4)反應(yīng)液中海藻糖的生成量。

酶活單位定義:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.6.4 海藻糖含量的HPLC分析

采用日立L-2000高效液相色譜儀檢測(cè)海藻糖含量。HPLC檢測(cè)條件為:NH2柱(APS-2 HYPERSIL，Thermo Scientific)，柱溫40℃，流動(dòng)相為80%乙腈水溶液，流速0.8 mL/min，示差折光檢測(cè)器。

2）季節(jié)溫差產(chǎn)生的溫度作用比較大，但是在工程實(shí)際中由于基礎(chǔ)的變形會(huì)釋放到一部分作用，在計(jì)算中應(yīng)考慮，否則會(huì)大幅度提高用鋼量。

1.6.5 SDS-PAGE蛋白電泳分析

使用購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳膠的制備，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12%，采用Tris-HCl，pH 8.3緩沖體系，電泳膠采用考馬斯亮藍(lán)G250(0.1%)染色。

2 結(jié)果分析

2.1 海藻糖合酶突變位點(diǎn)的選擇

本研究從NCBI中搜索嗜熱菌來(lái)源的、并且與本團(tuán)隊(duì)前期從嗜熱棲熱菌基因組獲得的海藻糖合酶氨基酸同源性為98%～99%的海藻糖合酶氨基酸序列，經(jīng)過多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第251位點(diǎn)處氨基酸較為特殊。一方面，該位點(diǎn)非常保守，除了本團(tuán)隊(duì)獲得的海藻糖合酶在該位點(diǎn)處為Pro，其他海藻糖合酶均為L(zhǎng)eu(圖1)。另一方面，以Mycobacterium smegmatis海藻糖合酶(PDB編號(hào)3zo9)為模板，利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)本團(tuán)隊(duì)獲得的海藻糖合酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于α-螺旋末端，由于Pro在二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有終止螺旋的作用，并且該螺旋一端的loop結(jié)構(gòu)與活性中心相連(圖2)，可能對(duì)其催化功能產(chǎn)生不利影響。因此，本研究嘗試將該251位點(diǎn)的Pro突變?yōu)長(zhǎng)eu，從而提高該位點(diǎn)附近結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻擋底物流失，提高轉(zhuǎn)化率。

圖1 不同嗜熱菌來(lái)源的海藻糖合酶多重序列比對(duì)Fig.1 Partial sequence alignments of trehalose synthase from different Thermus

圖2 嗜熱棲熱菌海藻糖合酶空間結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.2 Structure simulation of the T.thermophilus trehalose synthase

2.2 海藻糖合酶的定點(diǎn)突變和誘導(dǎo)表達(dá)

通過一步PCR法進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得了突變體P251L，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證突變成功，進(jìn)一步以E.coli BL21(DE3)為宿主菌進(jìn)行突變體的表達(dá)，在37℃培養(yǎng)溫度下經(jīng)搖瓶發(fā)酵28 h時(shí)OD600值為6.9，海藻糖合酶酶活達(dá)到最高值為6.9 U/mL(圖3)。經(jīng)SDSPAGE分析，在理論值大小106 kDa附近出現(xiàn)明顯目的條帶(圖4)。

圖3 搖瓶發(fā)酵重組菌生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酶情況Fig.3 The cell growth of recombinant E.coli and production of trehalose synthase

2.3 海藻糖合酶突變體制備海藻糖的工藝優(yōu)化

2.3.1 初始pH對(duì)海藻糖制備的影響

圖4 重組大腸桿菌發(fā)酵制備海藻糖合成酶的SDS-PAGE的分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant trehalose synthase

為了探究初始pH對(duì)海藻糖合酶突變體制備海藻糖的影響，利用不同pH(6.0～8.0)的20 mmol/L磷酸緩沖液配置0.3 g/mL的麥芽糖底物溶液，然后加入一定量的海藻糖合酶突變體在40℃下進(jìn)行酶反應(yīng)。從圖5a可知，當(dāng)初始pH在6.0～7.5范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率隨pH的升高從40.2%逐漸提高至59.4%。當(dāng)初始pH為7.5和8時(shí)，海藻糖合酶的轉(zhuǎn)化率均為59.4%。本研究選擇初始pH7.5繼續(xù)開展其他條件對(duì)制備海藻糖影響的研究。

2.3.2 溫度對(duì)海藻糖制備的影響

溫度是影響海藻糖制備的一個(gè)重要因素，將反應(yīng)體系初始pH設(shè)置為7.5，其他反應(yīng)條件不變，考察不同反應(yīng)溫度(30～60℃)對(duì)海藻糖的制備影響。如圖5b所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到62.0%。此外，還考察了在50℃其他pH條件下的轉(zhuǎn)化率情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率均低于62.0%。前期研究發(fā)現(xiàn)天然海藻糖合酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，但該溫度較適合多種微生物生長(zhǎng)，易造成微生物污染，導(dǎo)致麥芽糖和海藻糖的消耗，以及微生物生長(zhǎng)代謝引起的pH下降等問題，使得酶失活進(jìn)而轉(zhuǎn)化率降低。突變體的最適反應(yīng)溫度為50℃，降低了微生物生長(zhǎng)代謝帶來(lái)的弊端，在海藻糖制備的實(shí)際應(yīng)用中具有較大優(yōu)勢(shì)。

2.3.3 加酶量對(duì)海藻糖制備的影響

加酶量直接影響到生產(chǎn)成本，當(dāng)酶促反應(yīng)體系初始pH為7.5，反應(yīng)溫度為50℃，保證其他的反應(yīng)條件不變，加酶量為5～30 U/g麥芽糖時(shí)，如圖5c可知，當(dāng)加酶量為5～20 U/g時(shí)，麥芽糖酶轉(zhuǎn)化率隨加酶量的增加而逐漸提高，當(dāng)加酶量達(dá)到20 U/g麥芽糖時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.0%，繼續(xù)增大加酶量，轉(zhuǎn)化率不再繼續(xù)上升，因此選擇加酶量20 U/g麥芽糖，有利于降低工業(yè)成本，同時(shí)保證較高的轉(zhuǎn)化率。

2.3.4 底物濃度對(duì)海藻糖制備的影響

將酶促反應(yīng)體系初始反應(yīng)pH設(shè)置為7.5，反應(yīng)溫度設(shè)置為50℃，加酶量為20 U/g麥芽糖，在底物質(zhì)量濃度分別為0.1～0.6 g/mL下進(jìn)行酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5d所示，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度在0.1～0.5 g/mL范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率非常接近，分別為61.5%，62.0%，62.0%，61.9%和61.3%。然而，底物質(zhì)量濃度高于0.6 g/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率稍有下降，為54.4%。因此，總體而言，底物質(zhì)量濃度對(duì)海藻糖制備的影響不大，在實(shí)際應(yīng)用中，在較高底物質(zhì)量濃度下進(jìn)行酶反應(yīng)，有利于提高生產(chǎn)強(qiáng)度，減少生產(chǎn)成本。

2.4 采用工業(yè)級(jí)麥芽糖制備海藻糖的研究

在上述研究獲得了海藻糖制備最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探究了利用工業(yè)級(jí)麥芽糖制備海藻糖的情況。麥芽糖通常從淀粉水解獲得，此過程會(huì)產(chǎn)生一定的葡萄糖，從生產(chǎn)成本角度考慮，在海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)中，所使用的麥芽糖均含有一定量的葡萄糖。有報(bào)道顯示，以含有葡萄糖的底物進(jìn)行酶促反應(yīng)可能會(huì)因葡萄糖的抑制作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降［12-13］。因此，本研究考察了分別以含有0～0.07 g/mL葡萄糖的0.3 g/mL麥芽糖為底物的酶反應(yīng)情況。如圖6所示，當(dāng)葡萄糖含量為0～0.05 g/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率均保持在61.5% ～62.0%;葡萄糖含量為0.06 g/mL和0.07 g/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率分別為61.0%和60.2%。因此，當(dāng)?shù)孜镏泻?.01 g/mL～0.07 g/mL葡萄糖時(shí)，轉(zhuǎn)化率相差不大。

進(jìn)一步分別用國(guó)藥、羅蓋特(中國(guó))精細(xì)化工有限公司以及江蘇省奧谷生物科技有限公司生產(chǎn)的麥芽糖(葡萄糖含量分別為0，0.01，0.03 g/mL)為底物，制備海藻糖，轉(zhuǎn)化率分別為61.8%，61.8%和61.4%。由此可知，以工業(yè)級(jí)麥芽糖為底物制備海藻糖，對(duì)突變體的酶轉(zhuǎn)化率影響很小，具備工業(yè)化具備海藻糖的潛力。

圖6 葡萄糖含量對(duì)海藻糖生產(chǎn)的影響Fig.6 Effect of lactose concentration on trehalose production

3 結(jié)論

本團(tuán)隊(duì)前期工作中獲得了一種嗜熱棲熱菌來(lái)源的海藻糖合酶，但其催化制備海藻糖的轉(zhuǎn)化率較低。在本研究中，通過定點(diǎn)突變技術(shù)將其進(jìn)行了分子改造，獲得了突變體P251L，并在E.coli中進(jìn)行了重組表達(dá)。進(jìn)一步優(yōu)化了該突變體制備海藻糖的轉(zhuǎn)化條件，獲得了最優(yōu)反應(yīng)條件為:初始pH為7.5，溫度為50℃，加酶量為20 U/g麥芽糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值為62.0%，比天然酶提升了13.0%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同底物質(zhì)量濃度(0.1～0.5 g/mL)和少量的葡萄糖(0～0.07 g/mL)對(duì)酶反應(yīng)無(wú)明顯影響。該研究對(duì)于完善海藻糖合酶的催化性能和功能優(yōu)化提供了一定的借鑒意義，今后可繼續(xù)對(duì)海藻糖合酶進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提升其催化轉(zhuǎn)化制備海藻糖的應(yīng)用性能，從而為海藻糖的工業(yè)化制備奠定基礎(chǔ)。

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