• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    果汁DNA提取方法的比較

    2015-12-25 02:01:22齊玲倩劉秀丁夢(mèng)璇李靜媛劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)尹建軍
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:蘋(píng)果汁匯源離心管

    齊玲倩,劉秀,丁夢(mèng)璇,李靜媛,劉遠(yuǎn)遠(yuǎn),尹建軍

    (中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015)

    果汁是一種重要的飲品,但如今果汁摻假問(wèn)題日趨嚴(yán)重,如市場(chǎng)上存在著橙汁摻加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁,蘋(píng)果汁摻加梨汁、白葡萄汁,紅色漿果汁摻加蘋(píng)果汁及相互摻加等問(wèn)題[1-2]。這損害了消費(fèi)者的利益,阻礙了果汁行業(yè)的發(fā)展和國(guó)際貿(mào)易的進(jìn)行,因此,果汁中水果成分的檢測(cè)顯得尤為重要。

    分子生物學(xué)技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn),能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地從基因水平分析果汁的品種和來(lái)源,其結(jié)果為證明果汁的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁?jù)。目前,分子生物學(xué)方法在中草藥鑒定、肉類(lèi)鑒別上均有應(yīng)用,在果汁鑒偽領(lǐng)域亦有廣闊的發(fā)展空間[1,3-4]。然而,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行果汁鑒偽的關(guān)鍵是高質(zhì)量DNA提取方法的建立。由于果汁富含多糖、多酚、單寧、色素及一些次生代謝物質(zhì),使得DNA提取困難,如多酚類(lèi)物質(zhì)能使DNA氧化成棕褐色凝膠狀物,多糖類(lèi)物質(zhì)能與DNA結(jié)合成黏稠的膠狀物[5-7]。目前,常見(jiàn)的果汁DNA提取方法有CTAB法、改良試劑盒法、改良 CTAB 法等[8-10]。李富威等[11-12]應(yīng)用天根試劑盒提取木瓜汁、香蕉汁及食品中的DNA,建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因檢測(cè)方法,韓建勛等[13]使用改良CTAB法提取梨汁、蘋(píng)果汁中的DNA,建立了果汁中梨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,但是,沈夏艷等[14]采用改良試劑盒法提取的澄清蘋(píng)果汁DNA濃度較低,且果肉型蘋(píng)果汁提取純度也不高,Chang-Chai Ng等[15]采用改良CTAB方法可以提取鮮榨橙汁DNA,但不適合提取果汁飲料等的DNA。雖然從果汁中提取DNA的研究較多,但大部分集中在單一或較少種類(lèi)的果汁上,且有效性不高,而關(guān)于多種果汁的高效通用DNA提取方法研究較少。

    本文以匯源100%蘋(píng)果汁等7種渾濁果汁和百森紅蘋(píng)果汁等6種澄清果汁為研究對(duì)象,對(duì)比CTAB法、試劑盒法、改良CTAB法提取果汁DNA的濃度、純度及PCR擴(kuò)增效率,以期獲得高效通用的果汁DNA提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    果實(shí)樣品1種,桃;渾濁果汁樣品7種,包括鮮果粒蘋(píng)果汁(A)、匯源100%桃汁(B)、匯源山楂汁(C)、蘭芝藍(lán)莓原漿(D)、鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)、匯源100%梨汁(G);澄清果汁樣品6種,包括百森紅蘋(píng)果汁(a)、匯源冰糖葫蘆(b)、青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)、康師傅鮮果橙(d)、匯源100%葡萄汁(e)、梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f),均購(gòu)于北京超市。

    1.2 試劑

    DNA提取試劑:CTAB裂解液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH=8),CTAB 沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl),STE 核分離液(700 mmol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L EDTA,20 g/L PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮),pH=8),CTAB核裂解液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.05 mol/L EDTA,20 g/L PVP-40,pH=8),1.2 mol/L NaCl溶液,3.2 mol/L NaCl溶液(pH=5.2),Tirs飽和酚/三氯甲烷(體積比25∶24),三氯甲烷/異戊醇(體積比24∶1)。其他試劑或溶劑均為分析純級(jí)或生化純級(jí)。

    DP305植物基因組提取試劑盒:天根生化科技有限公司;PCR擴(kuò)增采用的 Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs,購(gòu)于北京全式金生物有限公司;RNaseA,DNA Marker DL 2 000;PCR擴(kuò)增引物,由英濰捷基(上海)生物有限公司合成。

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    微量移液器,德國(guó) Eppendorf公司;離心機(jī)(5804R型,5424型),德國(guó) Eppendorf公司;超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop),英國(guó)柏點(diǎn)公司;普通PCR擴(kuò)增儀,英國(guó)BIOMETRA公司;電泳儀(JY-300C),北京君意儀器公司;凝膠成像儀,法國(guó)VILBER公司。

    1.4 DNA提取方法

    1.4.1 CTAB 法[16]

    對(duì)于濁汁,取30 mL果汁于50 mL離心管中,8 679 r/min離心10 min,棄上清液;加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,振蕩混勻,65℃溫浴1 h,期間混勻幾次;8 679 r/min離心15 min,將1 mL上清液移至新的2 mL離心管中,加入700 μL的三氯甲烷,振蕩均勻,11 684 r/min離心10 min;吸取650 μL上清液移至2 mL離心管中,加入1.3 mL CTAB沉淀液,劇烈混勻,室溫靜置1 h;11 684 r/min離心10 min;加入350 μL NaCl(1.2 mol/L)溶液,劇烈振蕩,再加入350 μL三濾甲烷,劇烈振蕩,11 684 r/min離心10 min,吸取上清移至新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,-20℃靜置30 min;11 684 r/min離心20 min,棄上清液,加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀,11 684 r/min離心20 min;棄上清,將離心管倒置于超凈工作臺(tái)上10~15 min,吹干沉淀;用50 μL無(wú)菌超純水溶解沉淀,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中,真空干燥至剩余1 mL液體(若不足,加無(wú)菌超純水補(bǔ)足),將液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,振蕩混勻,65℃溫浴1 h,期間混勻幾次;其余步驟同濁汁。

    1.4.2 試劑盒法

    對(duì)于濁汁,取果汁1 mL裝入2 mL離心管中,加入700~800 μL緩沖液GP1,渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中,真空干燥至剩余1 mL液體(若不足,加超純水補(bǔ)足),將液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中,加入700~800 μL緩沖液GP1,渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

    1.4.3 改良CTAB法

    對(duì)于濁汁,取果汁1 mL于2 mL離心管中,加入1 mL異丙醇,混勻,-20℃靜置30 min,12 000 r/min,4 ℃,離心10 min,棄上清,在沉淀中加入600 μL STE核分離液,混勻,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液,14 μL β-巰基乙醇,混勻,65℃溫浴1 h,期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次,取出后,加入等體積Tirs飽和酚/三氯甲烷,振蕩混勻,靜置5 min,4℃,12 000 r/min離心10 min,取上清,加入等體積的三氯甲烷/異戊醇,振蕩混勻,靜置5 min,4℃,12 000 r/min離心10 min,取上清,加入1/10體積3.2 mol/L NaCl,等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻,-20℃靜置1 h,4℃,12 000 r/min離心15~20 min,棄上清,70%乙醇洗沉淀2次,倒置晾干后加入50 μL無(wú)菌超純水,混勻,-20℃保存。

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁于50 mL離心管中,11 000 r/min,4 ℃,離心 10 min,棄上清;向沉淀中加入3 mL STE核分離液,混勻,分2次轉(zhuǎn)入2 mL離心管,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,在沉淀中加入 700 μLCTAB 核裂解液,14 μL β-巰基乙醇,混勻,65℃溫浴1 h,期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次,其余步驟同濁汁。

    1.5 DNA提取質(zhì)量的測(cè)定

    取DNA溶液1 μL,用超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)測(cè)定以上3種方法提取的DNA在光波260 nm和280 nm處的紫外吸收值,通過(guò)OD260/OD280和濃度值判斷DNA的純度和濃度,每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

    用通用引物18SrDNA基因?qū)μ崛〉臉悠稤NA進(jìn)行擴(kuò)增,以驗(yàn)證提取的果汁DNA分子是否適合于PCR分析,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137 bp。

    引物序列為:

    18S rDNA-F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA;

    18S rDNA-R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT。

    擴(kuò)增體系:DNA模板2 μL;10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL;dNTPs(10 mmol/l)2 μL;上、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.25 μL,用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 果汁DNA提取效率的比較

    2.1.1 渾濁果汁DNA提取效率比較

    用CTAB法、試劑盒法法以及改良CTAB法提取7 種渾濁果汁飲料(A、B、C、D、E、F、G)的基因組,用Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度,結(jié)果列于表1。

    用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定在260 nm和280 nm處的紫外吸收值分別代表核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。對(duì)于高質(zhì)量的DNA樣品,OD260/OD280應(yīng)在1.8左右。當(dāng) OD260/OD280小于1.8時(shí),說(shuō)明DNA中存在蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染;反之,說(shuō)明DNA樣品存在RNA或小分子核酸污染。從表1數(shù)據(jù)可以看出,除茹夢(mèng)芒果汁(F)外,試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)在其余渾濁果汁飲料的核酸提取上,效果不理想。CTAB法在提取鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)DNA時(shí),濃度較高,但純度較差,而在其他果汁樣品DNA提取時(shí),濃度較低。改良CTAB法提取的DNA樣品的OD260/OD280,相對(duì)另2種方法更接近1.8,且DNA濃度更高,說(shuō)明使用改良CTAB法更適合提取渾濁果汁DNA,其中,應(yīng)用改良CTAB法提取蘭芝藍(lán)莓原漿(D)的DNA時(shí),濃度較低,可能是由于藍(lán)莓中花青素含量過(guò)多,影響了核酸的釋放。

    表1 不同方法提取的渾濁果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD,n=3)Table 1 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from juice nectar by different methods(a±SD,n=3)

    2.1.2 澄清果汁DNA提取效率的比較

    用CTAB法、試劑盒法以及改良CTAB法提取6種澄清果汁飲料(a,b,c,d,e,f)的基因組,用 Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度,結(jié)果列于表2。

    從表2數(shù)據(jù)可以看出,試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)無(wú)法提取到6種澄清果汁飲料中的核酸。CTAB法提取的青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)和康師傅鮮果橙(e)DNA,濃度相對(duì)較高,但純度較差,而提取的其他澄清果汁樣品DNA,濃度較低,純度也較差,且無(wú)法提取到匯源100%葡萄汁(e)的DNA。改良CTAB法提取的澄清果汁的 DNA,濃度相對(duì)更高,OD260/OD280相對(duì)更接近1.8,說(shuō)明改良CTAB法是較為合適的澄清果汁DNA提取方法。其中,應(yīng)用改良CTAB法提取百森紅蘋(píng)果汁(a)和梨工場(chǎng)梨汁(f)的DNA時(shí),濃度較低,可能是由于多酚類(lèi)物質(zhì)氧化物的存在,影響了核酸的釋放。

    表2 不同方法提取的澄清果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD,n=3)Table 2 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from clarified fruit juice by different methods(a±SD,n=3)

    2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以桃果肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,細(xì)菌DNA作為陰性對(duì)照,用通用引物18Sr DNA基因?qū)TAB法、試劑盒法和改良CTAB法提取的7種渾濁果汁飲料和6種澄清果汁飲料的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1~圖3。

    對(duì)比圖1~圖3可知,相對(duì)于CTAB法和試劑盒法,改良CTAB法提取的渾濁果汁DNA樣品,均可擴(kuò)增出18SrDNA基因的對(duì)應(yīng)條帶,且條帶較為清晰、明亮,但3號(hào)、4號(hào)條帶相對(duì)較暗,這可能是匯源山楂汁(C)和蘭芝藍(lán)莓原漿(D)相對(duì)較低的DNA濃度導(dǎo)致的;同時(shí),3種方法中,只有改良CTAB法提取的澄清果汁DNA樣品,對(duì)18Sr DNA基因的137 bp大小的目的片段均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增,但由于澄清果汁DNA含量普遍較低,故擴(kuò)增出的目的條帶較陽(yáng)性條帶暗。

    綜上,改良CTAB法提取的渾濁果汁和澄清果汁基因組DNA均可用于后續(xù)的PCR檢測(cè)研究。

    圖1 CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;2.陽(yáng)性對(duì)照:桃;3.匯源100%蘋(píng)果汁(A);4.匯源100%桃汁(B);5.匯源山楂汁(C);6.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);7.鮮果粒橙汁(E);8.茹夢(mèng)芒果汁(F);9.匯源100%梨汁(G);10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11、12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌;21.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.1 Electrophoresis profile of PCR productsof 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the CTAB method

    圖2 試劑盒法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);2.匯源100%蘋(píng)果汁(A);3.匯源100%桃汁(B);4.匯源山楂汁(C);5.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);6.鮮果粒橙汁(E);7.茹夢(mèng)芒果汁(F);8.匯源100%梨汁(G);9.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.陽(yáng)性對(duì)照:桃;12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.2 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the DNA extraction kit method

    圖3 改良CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);1.匯源100%蘋(píng)果汁(A);2.匯源100%桃汁(B);3.匯源山楂汁(C);4.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);5.鮮果粒橙汁(E);6.茹夢(mèng)芒果汁(F);7.匯源100%梨汁(G);8.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;9.陽(yáng)性對(duì)照:桃;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);12.百森紅蘋(píng)果汁(a);13.匯源冰糖葫蘆(b);14.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);15.康師傅鮮果橙(d);16.匯源100%葡萄汁(e);17.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);18.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌。Fig.3 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the modified CTAB method

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采取3種DNA提取方案從渾濁果汁和澄清果汁中提取DNA,通過(guò)比較DNA的純度、濃度,檢驗(yàn)DNA的PCR擴(kuò)增效率,確定了提取效率較高的方法-改良CTAB法,該方法從前處理方法、裂解液成分和異丙醇沉淀時(shí)間等方面對(duì)DNA提取方法存在的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)。首先,考慮到果汁中DNA含量相對(duì)較少,故對(duì)渾濁果汁采用異丙醇沉淀的方法對(duì)DNA進(jìn)行富集,對(duì)澄清果汁采取離心濃縮的方法進(jìn)行富集,簡(jiǎn)單易行,且提高了DNA的得率。其次,果汁樣品受次生代謝物質(zhì)的影響,致使DNA有限釋放,故在果汁樣品裂解前,預(yù)加核分離液去除部分多糖、多酚、色素等雜質(zhì),方便有效。再次,為抑制果汁中的多酚氧化并與DNA結(jié)合造成的褐變,在裂解液(700 μL)中加入20g/L PVP-40與體積分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇,從而提高樣品DNA的質(zhì)量以及PCR擴(kuò)增效率。最后,異丙醇沉淀時(shí)間對(duì)DNA純度有重要影響[17],沉淀時(shí)間越長(zhǎng),DNA濃度越高但純度越低,考慮到果汁DNA的濃度、純度以及提取過(guò)程的時(shí)耗,選擇在-20℃下沉淀1 h。

    最終建立的渾濁果汁和澄清果汁DNA的有效提取方法,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間,提高了DNA的提取效率,可為以后的果汁真實(shí)性基因檢測(cè)提供參考。

    [1] 蘇光明,胡小松.果汁鑒偽技術(shù)研究新進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(6):151-156.

    [2] 陳穎.話(huà)說(shuō)我國(guó)果汁業(yè)中的摻假問(wèn)題[J].中國(guó)果業(yè)信息,2013,30(6):39-41.

    [3] 陳穎,吳亞君.基因檢測(cè)技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用[J].色譜,2011,29(7):594-600.

    [4] HAN Jian-xun,WU Ya-jun,HUANG Wen-sheng,et al.PCR and DHPLC methods used to detect juice ingredient from 7 fruits[J].Food Control,2012,25(2):696-703.

    [5] 段婧婧,肖琳,陳軍.用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的水果果肉總DNA 提取法[J].食品科學(xué),2009,30(3):231-234.

    [6] 沈夏艷,陳穎,黃文勝,等.果汁鑒偽技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2007,4(17):63-66.

    [7] 高媛,杜國(guó)強(qiáng),師校欣.適于轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果種子和果肉總DNA提取的方法[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):238-241.

    [8] 劉偉紅,許文濤,商穎,等.果汁DNA提取方法比較及柑橘屬植物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(4):195-201.

    [9] 任君安,王國(guó)蘭,程曦,等.果蔬汁飲料DNA提取方法的比較研究[J].食品科技,2013,38(2):42-45.

    [10] 孫建霞,白衛(wèi)濱,曹春廷,等.蘋(píng)果汁和桃汁種類(lèi)特異性PCR檢測(cè)方法的研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(7):288-291.

    [11] 李富威,張舒亞,葉軍,等.食品中木瓜成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(11):51-56.

    [12] 李富威,張舒亞,葉軍,等.實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)食品中香蕉成分[J].食品科學(xué),2013,34(12):243-246.

    [13] 韓建勛,黃文勝,吳亞軍,等.果汁中梨成分分子生物學(xué)鑒偽-實(shí)時(shí)熒光PCR方法研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010,10(1):207-213.

    [14] 沈夏艷,陳穎,葛毅強(qiáng),等.蘋(píng)果汁中DNA提取方法的比較及 RAPD擴(kuò)增研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(2):18-23.

    [15] NG Chang-chai,CHANG Chen-chin,WU Chi-chi,et al.Rapid molecular identification of freshly squeezed and recon-stituted orange juice[J].Int J Food Sci Technol,2006,41(6):646-651.

    [16] SN/T 3729-2013.出口食品及飲料中常見(jiàn)水果品種的鑒定方法[S].

    [17] Sonia Ramos-Gómez,María D.Busto,Manuel Perez-Mateos,et al.Development of a method to recovery and amplification DNA by real-time PCR from commercial vegetable oils[J].Food Chemistry,2014,158(5):374-383.

    猜你喜歡
    蘋(píng)果汁匯源離心管
    重整方案獲批 匯源翻身有望
    音樂(lè)蘋(píng)果汁
    魔方型離心管架的設(shè)計(jì)及研發(fā)
    科技視界(2020年26期)2020-09-24 03:25:06
    離心管架研究現(xiàn)狀及魔尺型離心管架的設(shè)計(jì)
    科技視界(2020年17期)2020-07-30 14:03:27
    恐遭退市,匯源果汁難過(guò)“年關(guān)”
    燃燒條件演示實(shí)驗(yàn)的新設(shè)計(jì)
    酶制劑對(duì)渾濁蘋(píng)果汁懸濁穩(wěn)定性的改良效果研究
    蘋(píng)果汁國(guó)外主要市場(chǎng)的消費(fèi)特征與變化規(guī)律
    蘋(píng)果汁熒光特性的研究
    注射用頭孢唑肟鈉與維生素B6注射液的配伍穩(wěn)定性考察
    一本一本久久a久久精品综合妖精| 天美传媒精品一区二区| 在线 av 中文字幕| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产av一区二区精品久久| 国产精品av久久久久免费| 91国产中文字幕| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久 成人 亚洲| 在线观看www视频免费| 两个人免费观看高清视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩伦理黄色片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 97在线人人人人妻| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黄片小视频在线播放| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 老司机影院成人| 丝瓜视频免费看黄片| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美国产精品一级二级三级| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 丝袜美腿诱惑在线| 国产一区二区在线观看av| 久久 成人 亚洲| 18禁动态无遮挡网站| 午夜福利一区二区在线看| 国产成人精品久久久久久| 成人国产av品久久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 综合色丁香网| 丝袜在线中文字幕| 欧美人与善性xxx| 91国产中文字幕| 国产一区二区 视频在线| 欧美成人午夜精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 大香蕉久久成人网| 在线观看国产h片| 一级a爱视频在线免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 制服丝袜香蕉在线| 成人三级做爰电影| www日本在线高清视频| 乱人伦中国视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲av成人精品一二三区| 高清不卡的av网站| 男人舔女人的私密视频| 黄色一级大片看看| 操出白浆在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品国产国语对白av| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲精品一区蜜桃| 精品国产露脸久久av麻豆| 色婷婷av一区二区三区视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产爽快片一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本av免费视频播放| 国产成人av激情在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 视频区图区小说| 久久韩国三级中文字幕| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 午夜免费鲁丝| 成年av动漫网址| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲美女视频黄频| netflix在线观看网站| 亚洲少妇的诱惑av| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| www日本在线高清视频| 青草久久国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产精品无大码| 日本爱情动作片www.在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 五月开心婷婷网| 国产麻豆69| 日韩欧美精品免费久久| 免费少妇av软件| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 婷婷成人精品国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品日本国产第一区| 成年动漫av网址| 亚洲av中文av极速乱| 久久综合国产亚洲精品| 午夜精品国产一区二区电影| 色网站视频免费| 日韩大片免费观看网站| 国产 精品1| a级片在线免费高清观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 久久人人97超碰香蕉20202| 最近中文字幕2019免费版| 中文字幕色久视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产毛片在线视频| 日韩精品有码人妻一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美在线黄色| 久久性视频一级片| 国产成人免费无遮挡视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 麻豆av在线久日| 人人澡人人妻人| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲成人av在线免费| 中文字幕色久视频| 亚洲精品第二区| 国产在线视频一区二区| 国产成人91sexporn| 高清欧美精品videossex| 日韩精品免费视频一区二区三区| 观看av在线不卡| 9191精品国产免费久久| 男人添女人高潮全过程视频| 观看av在线不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 十八禁人妻一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲专区中文字幕在线 | 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲四区av| 久久久久久久精品精品| a级毛片黄视频| 久久婷婷青草| 国产黄色免费在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产成人一区二区在线| 日本午夜av视频| 中国国产av一级| 曰老女人黄片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成年人免费黄色播放视频| av免费观看日本| 人人澡人人妻人| 丝袜在线中文字幕| 黄片小视频在线播放| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕最新亚洲高清| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲国产精品999| 免费观看av网站的网址| 视频区图区小说| 日韩免费高清中文字幕av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产成人a∨麻豆精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人一区二区在线| a级毛片在线看网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一级爰片在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产精品欧美亚洲77777| 一本大道久久a久久精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产黄频视频在线观看| av一本久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲国产精品国产精品| 国产不卡av网站在线观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美精品一区二区免费开放| 免费观看性生交大片5| 国产精品久久久久久精品古装| 蜜桃在线观看..| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲七黄色美女视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 日本91视频免费播放| 18禁国产床啪视频网站| 国产熟女欧美一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产99久久九九免费精品| 99久国产av精品国产电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费在线观看完整版高清| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 丝袜美腿诱惑在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 午夜免费观看性视频| 国产黄色免费在线视频| 国产视频首页在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日本91视频免费播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 街头女战士在线观看网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久久久久大尺度免费视频| 免费少妇av软件| 熟女av电影| 欧美精品一区二区大全| 99热国产这里只有精品6| 久久久久人妻精品一区果冻| 水蜜桃什么品种好| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美黑人精品巨大| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产乱码久久久久久小说| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 丁香六月欧美| 国产精品免费视频内射| 新久久久久国产一级毛片| 国产又色又爽无遮挡免| 最近最新中文字幕大全免费视频 | bbb黄色大片| 日韩av免费高清视频| 色播在线永久视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 两个人免费观看高清视频| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品成人在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久久久久久久免费视频了| 久热爱精品视频在线9| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产av码专区亚洲av| 国产一区二区三区av在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 又黄又粗又硬又大视频| 丁香六月天网| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产国语露脸激情在线看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产老妇伦熟女老妇高清| 丁香六月天网| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品一国产av| 777米奇影视久久| av国产久精品久网站免费入址| 在线观看www视频免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产av码专区亚洲av| 99热网站在线观看| 免费观看性生交大片5| 午夜精品国产一区二区电影| 18禁国产床啪视频网站| 成人手机av| 精品一区在线观看国产| 中文字幕精品免费在线观看视频| 中文字幕亚洲精品专区| 一个人免费看片子| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 观看av在线不卡| 国产免费视频播放在线视频| 中文字幕制服av| 亚洲国产精品999| 天天操日日干夜夜撸| 午夜老司机福利片| av国产精品久久久久影院| 亚洲熟女毛片儿| 黄片小视频在线播放| 日本av免费视频播放| 久久影院123| 一级黄片播放器| 国产淫语在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲天堂av无毛| 制服人妻中文乱码| 丝袜脚勾引网站| 日韩视频在线欧美| 欧美在线一区亚洲| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 2021少妇久久久久久久久久久| 丝袜喷水一区| 看十八女毛片水多多多| 七月丁香在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 一区二区三区激情视频| 午夜福利乱码中文字幕| 一区在线观看完整版| av国产久精品久网站免费入址| 国产亚洲一区二区精品| 人妻 亚洲 视频| 老鸭窝网址在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 99久久99久久久精品蜜桃| 高清在线视频一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕色久视频| 热99国产精品久久久久久7| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲在久久综合| 亚洲欧洲国产日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 色94色欧美一区二区| 日本av免费视频播放| 久久久久人妻精品一区果冻| 秋霞在线观看毛片| 黄片小视频在线播放| 国产精品无大码| 亚洲情色 制服丝袜| 一级黄片播放器| 久久天堂一区二区三区四区| 久久性视频一级片| 一区二区三区四区激情视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 狂野欧美激情性bbbbbb| 黄片小视频在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 乱人伦中国视频| 最近中文字幕2019免费版| 精品一区二区免费观看| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品一区蜜桃| 最近中文字幕2019免费版| 99热网站在线观看| 午夜91福利影院| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品三级大全| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲成色77777| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 秋霞在线观看毛片| 黄片小视频在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝袜脚勾引网站| 亚洲第一青青草原| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产成人系列免费观看| 永久免费av网站大全| 高清av免费在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品自拍成人| 午夜免费鲁丝| 男女午夜视频在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 成年av动漫网址| 国产av精品麻豆| 欧美日韩福利视频一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品自拍成人| 91老司机精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 黄色视频不卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 美女国产高潮福利片在线看| 蜜桃在线观看..| 日本午夜av视频| 无限看片的www在线观看| 久热这里只有精品99| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线观看人妻少妇| 久久久亚洲精品成人影院| 在线观看国产h片| 久久久久久人人人人人| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲综合色网址| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲美女搞黄在线观看| 国产av精品麻豆| 国产男人的电影天堂91| 秋霞在线观看毛片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲一区中文字幕在线| 宅男免费午夜| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品亚洲成国产av| 制服诱惑二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 老熟女久久久| 国产一区二区激情短视频 | 国产一级毛片在线| 在线天堂最新版资源| 多毛熟女@视频| 午夜精品国产一区二区电影| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产高清国产精品国产三级| av线在线观看网站| 国产精品 国内视频| 国产成人免费无遮挡视频| 男人添女人高潮全过程视频| 香蕉国产在线看| 国产在视频线精品| 亚洲精品一二三| 久久这里只有精品19| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人精品福利久久| xxx大片免费视频| 国产精品久久久久久精品古装| 麻豆av在线久日| av在线播放精品| avwww免费| 日本一区二区免费在线视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一级片'在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 欧美xxⅹ黑人| 国产av国产精品国产| 在线观看免费视频网站a站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 天堂中文最新版在线下载| 天堂8中文在线网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 青草久久国产| 亚洲精品日本国产第一区| 国产成人精品福利久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人毛片60女人毛片免费| 国产免费视频播放在线视频| 久久婷婷青草| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 少妇人妻精品综合一区二区| 大陆偷拍与自拍| 两个人看的免费小视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 女性生殖器流出的白浆| svipshipincom国产片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久99精品国语久久久| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕色久视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | av国产久精品久网站免费入址| 国产毛片在线视频| 高清av免费在线| 久久久久久人妻| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美日韩精品网址| 丝袜美腿诱惑在线| 免费观看性生交大片5| 秋霞伦理黄片| 中国三级夫妇交换| 久久人人97超碰香蕉20202| 18在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频| 老司机影院毛片| 黄色怎么调成土黄色| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人欧美在线观看 | 国产国语露脸激情在线看| 麻豆乱淫一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 少妇的丰满在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久性视频一级片| 下体分泌物呈黄色| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 精品久久蜜臀av无| av线在线观看网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久欧美国产精品| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲人成77777在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 成人午夜精彩视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 午夜福利在线免费观看网站| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲视频免费观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 涩涩av久久男人的天堂| 操出白浆在线播放| 性色av一级| 日韩av在线免费看完整版不卡| 99久国产av精品国产电影| 免费高清在线观看日韩| 免费观看性生交大片5| 国产一卡二卡三卡精品 | 无限看片的www在线观看| 久久久国产精品麻豆| 啦啦啦中文免费视频观看日本| kizo精华| 黑人猛操日本美女一级片| 国产色婷婷99| 亚洲成国产人片在线观看| av在线app专区| 久久这里只有精品19| 18禁动态无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线| 亚洲熟女毛片儿| 18在线观看网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产成人精品无人区| 欧美乱码精品一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| av国产精品久久久久影院| www.av在线官网国产| 午夜福利视频精品| 岛国毛片在线播放| 日韩欧美精品免费久久| av女优亚洲男人天堂| 制服丝袜香蕉在线| 高清欧美精品videossex| 在线天堂最新版资源| 好男人视频免费观看在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 国精品久久久久久国模美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久99热这里只频精品6学生| 99re6热这里在线精品视频| 黄片播放在线免费| 蜜桃在线观看..| 久久久久精品国产欧美久久久 | 在线观看免费日韩欧美大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品国产三级专区第一集| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 黄色一级大片看看| 久久韩国三级中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 日日摸夜夜添夜夜爱| 五月开心婷婷网| 亚洲成人手机| 叶爱在线成人免费视频播放| 一级毛片我不卡| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品国产国语对白av| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲精品国产av成人精品| 免费观看av网站的网址| 老司机深夜福利视频在线观看 | 又黄又粗又硬又大视频| 51午夜福利影视在线观看| www日本在线高清视频| 精品福利永久在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 两性夫妻黄色片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 男人操女人黄网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久久久国产电影| 日本wwww免费看| videos熟女内射| 大码成人一级视频| avwww免费| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱|