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    果汁DNA提取方法的比較

    2015-12-25 02:01:22齊玲倩劉秀丁夢(mèng)璇李靜媛劉遠(yuǎn)遠(yuǎn)尹建軍
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:蘋(píng)果汁匯源離心管

    齊玲倩,劉秀,丁夢(mèng)璇,李靜媛,劉遠(yuǎn)遠(yuǎn),尹建軍

    (中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015)

    果汁是一種重要的飲品,但如今果汁摻假問(wèn)題日趨嚴(yán)重,如市場(chǎng)上存在著橙汁摻加柑橘汁、西柚汁、胡柚汁,蘋(píng)果汁摻加梨汁、白葡萄汁,紅色漿果汁摻加蘋(píng)果汁及相互摻加等問(wèn)題[1-2]。這損害了消費(fèi)者的利益,阻礙了果汁行業(yè)的發(fā)展和國(guó)際貿(mào)易的進(jìn)行,因此,果汁中水果成分的檢測(cè)顯得尤為重要。

    分子生物學(xué)技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn),能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地從基因水平分析果汁的品種和來(lái)源,其結(jié)果為證明果汁的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁?jù)。目前,分子生物學(xué)方法在中草藥鑒定、肉類(lèi)鑒別上均有應(yīng)用,在果汁鑒偽領(lǐng)域亦有廣闊的發(fā)展空間[1,3-4]。然而,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行果汁鑒偽的關(guān)鍵是高質(zhì)量DNA提取方法的建立。由于果汁富含多糖、多酚、單寧、色素及一些次生代謝物質(zhì),使得DNA提取困難,如多酚類(lèi)物質(zhì)能使DNA氧化成棕褐色凝膠狀物,多糖類(lèi)物質(zhì)能與DNA結(jié)合成黏稠的膠狀物[5-7]。目前,常見(jiàn)的果汁DNA提取方法有CTAB法、改良試劑盒法、改良 CTAB 法等[8-10]。李富威等[11-12]應(yīng)用天根試劑盒提取木瓜汁、香蕉汁及食品中的DNA,建立了食品中木瓜和香蕉成分的基因檢測(cè)方法,韓建勛等[13]使用改良CTAB法提取梨汁、蘋(píng)果汁中的DNA,建立了果汁中梨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,但是,沈夏艷等[14]采用改良試劑盒法提取的澄清蘋(píng)果汁DNA濃度較低,且果肉型蘋(píng)果汁提取純度也不高,Chang-Chai Ng等[15]采用改良CTAB方法可以提取鮮榨橙汁DNA,但不適合提取果汁飲料等的DNA。雖然從果汁中提取DNA的研究較多,但大部分集中在單一或較少種類(lèi)的果汁上,且有效性不高,而關(guān)于多種果汁的高效通用DNA提取方法研究較少。

    本文以匯源100%蘋(píng)果汁等7種渾濁果汁和百森紅蘋(píng)果汁等6種澄清果汁為研究對(duì)象,對(duì)比CTAB法、試劑盒法、改良CTAB法提取果汁DNA的濃度、純度及PCR擴(kuò)增效率,以期獲得高效通用的果汁DNA提取方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    果實(shí)樣品1種,桃;渾濁果汁樣品7種,包括鮮果粒蘋(píng)果汁(A)、匯源100%桃汁(B)、匯源山楂汁(C)、蘭芝藍(lán)莓原漿(D)、鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)、匯源100%梨汁(G);澄清果汁樣品6種,包括百森紅蘋(píng)果汁(a)、匯源冰糖葫蘆(b)、青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)、康師傅鮮果橙(d)、匯源100%葡萄汁(e)、梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f),均購(gòu)于北京超市。

    1.2 試劑

    DNA提取試劑:CTAB裂解液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH=8),CTAB 沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl),STE 核分離液(700 mmol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L EDTA,20 g/L PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮),pH=8),CTAB核裂解液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.05 mol/L EDTA,20 g/L PVP-40,pH=8),1.2 mol/L NaCl溶液,3.2 mol/L NaCl溶液(pH=5.2),Tirs飽和酚/三氯甲烷(體積比25∶24),三氯甲烷/異戊醇(體積比24∶1)。其他試劑或溶劑均為分析純級(jí)或生化純級(jí)。

    DP305植物基因組提取試劑盒:天根生化科技有限公司;PCR擴(kuò)增采用的 Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs,購(gòu)于北京全式金生物有限公司;RNaseA,DNA Marker DL 2 000;PCR擴(kuò)增引物,由英濰捷基(上海)生物有限公司合成。

    1.3 主要儀器與設(shè)備

    微量移液器,德國(guó) Eppendorf公司;離心機(jī)(5804R型,5424型),德國(guó) Eppendorf公司;超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop),英國(guó)柏點(diǎn)公司;普通PCR擴(kuò)增儀,英國(guó)BIOMETRA公司;電泳儀(JY-300C),北京君意儀器公司;凝膠成像儀,法國(guó)VILBER公司。

    1.4 DNA提取方法

    1.4.1 CTAB 法[16]

    對(duì)于濁汁,取30 mL果汁于50 mL離心管中,8 679 r/min離心10 min,棄上清液;加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,振蕩混勻,65℃溫浴1 h,期間混勻幾次;8 679 r/min離心15 min,將1 mL上清液移至新的2 mL離心管中,加入700 μL的三氯甲烷,振蕩均勻,11 684 r/min離心10 min;吸取650 μL上清液移至2 mL離心管中,加入1.3 mL CTAB沉淀液,劇烈混勻,室溫靜置1 h;11 684 r/min離心10 min;加入350 μL NaCl(1.2 mol/L)溶液,劇烈振蕩,再加入350 μL三濾甲烷,劇烈振蕩,11 684 r/min離心10 min,吸取上清移至新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,-20℃靜置30 min;11 684 r/min離心20 min,棄上清液,加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀,11 684 r/min離心20 min;棄上清,將離心管倒置于超凈工作臺(tái)上10~15 min,吹干沉淀;用50 μL無(wú)菌超純水溶解沉淀,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中,真空干燥至剩余1 mL液體(若不足,加無(wú)菌超純水補(bǔ)足),將液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,加入5 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,振蕩混勻,65℃溫浴1 h,期間混勻幾次;其余步驟同濁汁。

    1.4.2 試劑盒法

    對(duì)于濁汁,取果汁1 mL裝入2 mL離心管中,加入700~800 μL緩沖液GP1,渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁至潔凈培養(yǎng)皿中,真空干燥至剩余1 mL液體(若不足,加超純水補(bǔ)足),將液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中,加入700~800 μL緩沖液GP1,渦旋振蕩30 s。隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

    1.4.3 改良CTAB法

    對(duì)于濁汁,取果汁1 mL于2 mL離心管中,加入1 mL異丙醇,混勻,-20℃靜置30 min,12 000 r/min,4 ℃,離心10 min,棄上清,在沉淀中加入600 μL STE核分離液,混勻,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,在沉淀中加入700 μL CTAB核裂解液,14 μL β-巰基乙醇,混勻,65℃溫浴1 h,期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次,取出后,加入等體積Tirs飽和酚/三氯甲烷,振蕩混勻,靜置5 min,4℃,12 000 r/min離心10 min,取上清,加入等體積的三氯甲烷/異戊醇,振蕩混勻,靜置5 min,4℃,12 000 r/min離心10 min,取上清,加入1/10體積3.2 mol/L NaCl,等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻,-20℃靜置1 h,4℃,12 000 r/min離心15~20 min,棄上清,70%乙醇洗沉淀2次,倒置晾干后加入50 μL無(wú)菌超純水,混勻,-20℃保存。

    對(duì)于清汁,取30 mL果汁于50 mL離心管中,11 000 r/min,4 ℃,離心 10 min,棄上清;向沉淀中加入3 mL STE核分離液,混勻,分2次轉(zhuǎn)入2 mL離心管,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,在沉淀中加入 700 μLCTAB 核裂解液,14 μL β-巰基乙醇,混勻,65℃溫浴1 h,期間不時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管幾次,其余步驟同濁汁。

    1.5 DNA提取質(zhì)量的測(cè)定

    取DNA溶液1 μL,用超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)測(cè)定以上3種方法提取的DNA在光波260 nm和280 nm處的紫外吸收值,通過(guò)OD260/OD280和濃度值判斷DNA的純度和濃度,每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

    用通用引物18SrDNA基因?qū)μ崛〉臉悠稤NA進(jìn)行擴(kuò)增,以驗(yàn)證提取的果汁DNA分子是否適合于PCR分析,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為137 bp。

    引物序列為:

    18S rDNA-F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA;

    18S rDNA-R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT。

    擴(kuò)增體系:DNA模板2 μL;10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL;dNTPs(10 mmol/l)2 μL;上、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL;Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.25 μL,用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 果汁DNA提取效率的比較

    2.1.1 渾濁果汁DNA提取效率比較

    用CTAB法、試劑盒法法以及改良CTAB法提取7 種渾濁果汁飲料(A、B、C、D、E、F、G)的基因組,用Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度,結(jié)果列于表1。

    用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定在260 nm和280 nm處的紫外吸收值分別代表核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。對(duì)于高質(zhì)量的DNA樣品,OD260/OD280應(yīng)在1.8左右。當(dāng) OD260/OD280小于1.8時(shí),說(shuō)明DNA中存在蛋白質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)的污染;反之,說(shuō)明DNA樣品存在RNA或小分子核酸污染。從表1數(shù)據(jù)可以看出,除茹夢(mèng)芒果汁(F)外,試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)在其余渾濁果汁飲料的核酸提取上,效果不理想。CTAB法在提取鮮果粒橙汁(E)、茹夢(mèng)芒果汁(F)DNA時(shí),濃度較高,但純度較差,而在其他果汁樣品DNA提取時(shí),濃度較低。改良CTAB法提取的DNA樣品的OD260/OD280,相對(duì)另2種方法更接近1.8,且DNA濃度更高,說(shuō)明使用改良CTAB法更適合提取渾濁果汁DNA,其中,應(yīng)用改良CTAB法提取蘭芝藍(lán)莓原漿(D)的DNA時(shí),濃度較低,可能是由于藍(lán)莓中花青素含量過(guò)多,影響了核酸的釋放。

    表1 不同方法提取的渾濁果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD,n=3)Table 1 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from juice nectar by different methods(a±SD,n=3)

    2.1.2 澄清果汁DNA提取效率的比較

    用CTAB法、試劑盒法以及改良CTAB法提取6種澄清果汁飲料(a,b,c,d,e,f)的基因組,用 Biodrop超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定以上3種方法提取的DNA的純度和濃度,結(jié)果列于表2。

    從表2數(shù)據(jù)可以看出,試劑盒法(天根植物基因組提取試劑盒)無(wú)法提取到6種澄清果汁飲料中的核酸。CTAB法提取的青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c)和康師傅鮮果橙(e)DNA,濃度相對(duì)較高,但純度較差,而提取的其他澄清果汁樣品DNA,濃度較低,純度也較差,且無(wú)法提取到匯源100%葡萄汁(e)的DNA。改良CTAB法提取的澄清果汁的 DNA,濃度相對(duì)更高,OD260/OD280相對(duì)更接近1.8,說(shuō)明改良CTAB法是較為合適的澄清果汁DNA提取方法。其中,應(yīng)用改良CTAB法提取百森紅蘋(píng)果汁(a)和梨工場(chǎng)梨汁(f)的DNA時(shí),濃度較低,可能是由于多酚類(lèi)物質(zhì)氧化物的存在,影響了核酸的釋放。

    表2 不同方法提取的澄清果汁DNA濃度和純度的比較(a±SD,n=3)Table 2 Comparison of purity and concentration of DNA extracted from clarified fruit juice by different methods(a±SD,n=3)

    2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以桃果肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,細(xì)菌DNA作為陰性對(duì)照,用通用引物18Sr DNA基因?qū)TAB法、試劑盒法和改良CTAB法提取的7種渾濁果汁飲料和6種澄清果汁飲料的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1~圖3。

    對(duì)比圖1~圖3可知,相對(duì)于CTAB法和試劑盒法,改良CTAB法提取的渾濁果汁DNA樣品,均可擴(kuò)增出18SrDNA基因的對(duì)應(yīng)條帶,且條帶較為清晰、明亮,但3號(hào)、4號(hào)條帶相對(duì)較暗,這可能是匯源山楂汁(C)和蘭芝藍(lán)莓原漿(D)相對(duì)較低的DNA濃度導(dǎo)致的;同時(shí),3種方法中,只有改良CTAB法提取的澄清果汁DNA樣品,對(duì)18Sr DNA基因的137 bp大小的目的片段均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增,但由于澄清果汁DNA含量普遍較低,故擴(kuò)增出的目的條帶較陽(yáng)性條帶暗。

    綜上,改良CTAB法提取的渾濁果汁和澄清果汁基因組DNA均可用于后續(xù)的PCR檢測(cè)研究。

    圖1 CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;2.陽(yáng)性對(duì)照:桃;3.匯源100%蘋(píng)果汁(A);4.匯源100%桃汁(B);5.匯源山楂汁(C);6.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);7.鮮果粒橙汁(E);8.茹夢(mèng)芒果汁(F);9.匯源100%梨汁(G);10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11、12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌;21.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.1 Electrophoresis profile of PCR productsof 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the CTAB method

    圖2 試劑盒法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);2.匯源100%蘋(píng)果汁(A);3.匯源100%桃汁(B);4.匯源山楂汁(C);5.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);6.鮮果粒橙汁(E);7.茹夢(mèng)芒果汁(F);8.匯源100%梨汁(G);9.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.陽(yáng)性對(duì)照:桃;12.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);13.百森紅蘋(píng)果汁(a);14.匯源冰糖葫蘆(b);15.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);16.康師傅鮮果橙(d);17.匯源100%葡萄汁(e);18.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水。Fig.2 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the DNA extraction kit method

    圖3 改良CTAB法提取的果汁基因組18SrDNA基因PCR電泳檢測(cè)圖譜注:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);1.匯源100%蘋(píng)果汁(A);2.匯源100%桃汁(B);3.匯源山楂汁(C);4.蘭芝藍(lán)莓原漿(D);5.鮮果粒橙汁(E);6.茹夢(mèng)芒果汁(F);7.匯源100%梨汁(G);8.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;9.陽(yáng)性對(duì)照:桃;10.陰性對(duì)照:細(xì)菌;11.M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(2000);12.百森紅蘋(píng)果汁(a);13.匯源冰糖葫蘆(b);14.青蘋(píng)果藍(lán)莓汁(c);15.康師傅鮮果橙(d);16.匯源100%葡萄汁(e);17.梨工場(chǎng)冰糖雪梨(f);18.空白對(duì)照:無(wú)菌超純水;19.陽(yáng)性對(duì)照:桃;20.陰性對(duì)照:細(xì)菌。Fig.3 Electrophoresis profile of PCR products amplifiedby 18SrDNA gene primer in different juice DNA samples extracted by the modified CTAB method

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采取3種DNA提取方案從渾濁果汁和澄清果汁中提取DNA,通過(guò)比較DNA的純度、濃度,檢驗(yàn)DNA的PCR擴(kuò)增效率,確定了提取效率較高的方法-改良CTAB法,該方法從前處理方法、裂解液成分和異丙醇沉淀時(shí)間等方面對(duì)DNA提取方法存在的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)。首先,考慮到果汁中DNA含量相對(duì)較少,故對(duì)渾濁果汁采用異丙醇沉淀的方法對(duì)DNA進(jìn)行富集,對(duì)澄清果汁采取離心濃縮的方法進(jìn)行富集,簡(jiǎn)單易行,且提高了DNA的得率。其次,果汁樣品受次生代謝物質(zhì)的影響,致使DNA有限釋放,故在果汁樣品裂解前,預(yù)加核分離液去除部分多糖、多酚、色素等雜質(zhì),方便有效。再次,為抑制果汁中的多酚氧化并與DNA結(jié)合造成的褐變,在裂解液(700 μL)中加入20g/L PVP-40與體積分?jǐn)?shù)2%β-巰基乙醇,從而提高樣品DNA的質(zhì)量以及PCR擴(kuò)增效率。最后,異丙醇沉淀時(shí)間對(duì)DNA純度有重要影響[17],沉淀時(shí)間越長(zhǎng),DNA濃度越高但純度越低,考慮到果汁DNA的濃度、純度以及提取過(guò)程的時(shí)耗,選擇在-20℃下沉淀1 h。

    最終建立的渾濁果汁和澄清果汁DNA的有效提取方法,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間,提高了DNA的提取效率,可為以后的果汁真實(shí)性基因檢測(cè)提供參考。

    [1] 蘇光明,胡小松.果汁鑒偽技術(shù)研究新進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(6):151-156.

    [2] 陳穎.話(huà)說(shuō)我國(guó)果汁業(yè)中的摻假問(wèn)題[J].中國(guó)果業(yè)信息,2013,30(6):39-41.

    [3] 陳穎,吳亞君.基因檢測(cè)技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用[J].色譜,2011,29(7):594-600.

    [4] HAN Jian-xun,WU Ya-jun,HUANG Wen-sheng,et al.PCR and DHPLC methods used to detect juice ingredient from 7 fruits[J].Food Control,2012,25(2):696-703.

    [5] 段婧婧,肖琳,陳軍.用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的水果果肉總DNA 提取法[J].食品科學(xué),2009,30(3):231-234.

    [6] 沈夏艷,陳穎,黃文勝,等.果汁鑒偽技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2007,4(17):63-66.

    [7] 高媛,杜國(guó)強(qiáng),師校欣.適于轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果種子和果肉總DNA提取的方法[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(16):238-241.

    [8] 劉偉紅,許文濤,商穎,等.果汁DNA提取方法比較及柑橘屬植物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(4):195-201.

    [9] 任君安,王國(guó)蘭,程曦,等.果蔬汁飲料DNA提取方法的比較研究[J].食品科技,2013,38(2):42-45.

    [10] 孫建霞,白衛(wèi)濱,曹春廷,等.蘋(píng)果汁和桃汁種類(lèi)特異性PCR檢測(cè)方法的研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(7):288-291.

    [11] 李富威,張舒亞,葉軍,等.食品中木瓜成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(11):51-56.

    [12] 李富威,張舒亞,葉軍,等.實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)食品中香蕉成分[J].食品科學(xué),2013,34(12):243-246.

    [13] 韓建勛,黃文勝,吳亞軍,等.果汁中梨成分分子生物學(xué)鑒偽-實(shí)時(shí)熒光PCR方法研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010,10(1):207-213.

    [14] 沈夏艷,陳穎,葛毅強(qiáng),等.蘋(píng)果汁中DNA提取方法的比較及 RAPD擴(kuò)增研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(2):18-23.

    [15] NG Chang-chai,CHANG Chen-chin,WU Chi-chi,et al.Rapid molecular identification of freshly squeezed and recon-stituted orange juice[J].Int J Food Sci Technol,2006,41(6):646-651.

    [16] SN/T 3729-2013.出口食品及飲料中常見(jiàn)水果品種的鑒定方法[S].

    [17] Sonia Ramos-Gómez,María D.Busto,Manuel Perez-Mateos,et al.Development of a method to recovery and amplification DNA by real-time PCR from commercial vegetable oils[J].Food Chemistry,2014,158(5):374-383.

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