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    基于內(nèi)濾效應(yīng)熒光檢測牛奶中土霉素含量*

    2015-12-25 01:59:34毛永強(qiáng)梁密李寧李娜
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:激發(fā)光譜土霉素量子

    毛永強(qiáng),梁密,李寧,李娜

    (遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院,遼寧阜新,123000)

    土霉素(oxytetracycline,OTC)是一種廣譜抗生素,在農(nóng)畜牧業(yè)上曾作為預(yù)防、治療畜禽疾病的動物藥物和促進(jìn)畜禽生長的飼料添加劑而廣泛使用。但過量使用,在動物性食品中的土霉素殘留易通過食物鏈危害人體健康,因此許多國家已經(jīng)對食品中土霉素最大殘留限量做出規(guī)定[1-2]?,F(xiàn)有土霉素殘留的檢測方法主要有紫外分光光度法[3]、熒光光度法[4]、液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、電化學(xué)傳感器[9]等,但上述方法儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜耗時,因此建立一種簡便、快速、靈敏的土霉素含量檢測方法對于保障人民身體健康具有重要意義。

    量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)是一種熒光納米材料,因其激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、顏色可調(diào)、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)引起研究者的廣泛關(guān)注,并以其作為熒光探針已用于致病菌[10]、生物毒素[11]、農(nóng)獸藥殘留[12-13]、非法添加劑[14]和重金屬[15]等食品分析檢測領(lǐng)域。內(nèi)濾效應(yīng)(Inner-filter effect,IFE)是在非共價偶聯(lián)熒光傳感體系中,因熒光體的激發(fā)光譜與吸收體的吸收光譜有相當(dāng)程度的重疊,而導(dǎo)致熒光體的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著降低。內(nèi)濾光效應(yīng)將吸光體的光吸收信號轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮殪`敏的熒光信號,從而提高檢測方法的靈敏度,已經(jīng)用于三聚氰胺、氰化物的定量檢測[16-17]。

    本文通過水熱合成巰基乙酸修飾的CdTe量子點(diǎn),發(fā)現(xiàn)土霉素的吸收光譜和CdTe量子點(diǎn)的熒光激發(fā)光譜有很大程度的重疊,基于土霉素和CdTe量子點(diǎn)之間的內(nèi)濾效應(yīng),即土霉素吸收CdTe量子點(diǎn)發(fā)射的激發(fā)光能量,引起CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度顯著降低,且CdTe量子點(diǎn)的熒光猝滅強(qiáng)度與土霉素濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,建立一種測定土霉素含量的熒光分析法。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    F-4500型熒光分光光度計(jì),日立公司;UV-3010型紫外-可見分光光度計(jì),日立公司;AUX320型電子分析天平,島津公司;pHS-3C型pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

    碲粉,硼氫化鈉(NaBH4),巰基乙酸,氯化鎘(CdCl2·2.5H2O),所用試劑均為分析純;土霉素,美國飛世爾科學(xué)世界公司;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

    袋裝鮮牛奶樣品,購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 CdTe量子點(diǎn)的合成

    采用水熱法合成巰基乙酸修飾的 CdTe量子點(diǎn)[18]。準(zhǔn)確稱取43 mg碲粉和80 mg NaBH4,加入5 mL蒸餾水溶解,在氮?dú)獗Wo(hù)下,4℃冰浴中磁力攪拌反應(yīng)8 h,即生成NaHTe前驅(qū)體溶液。在250 mL三口燒瓶中加入0.142 7 g CdCl2,100 mL蒸餾水溶解后,逐滴加入107 μL巰基乙酸溶液,用1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為11.0,通氮?dú)?0 min后,磁力攪拌下注入新制備NaHTe溶液;繼續(xù)通氮?dú)猓?00℃油浴反應(yīng)2 h,得到實(shí)驗(yàn)所需的水溶性CdTe量子點(diǎn)。合成的CdTe量子點(diǎn)溶液中加入無水乙醇,離心后收集沉淀,用去離子水將其重新溶解,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 熒光測定

    在5 mL比色管中,加入0.2 mL的CdTe量子點(diǎn)溶液、0.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(pH值6.5)和一定體積的土霉素標(biāo)準(zhǔn)液或提取液,蒸餾水定容到刻度并搖勻。室溫下放置5 min后,在激發(fā)波長330 nm條件下(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm),分別測定加入土霉素溶液前后體系在激發(fā)波長520 nm處的熒光強(qiáng)度F0和F,計(jì)算體系的熒光猝滅值ΔF=F0-F。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 土霉素與CdTe量子點(diǎn)之間的反應(yīng)機(jī)理

    采用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法,考察CdTe量子點(diǎn)的激發(fā)光譜和土霉素的紫外-可見吸收光譜(如圖1所示)。由圖1可以看出,在200~400 nm內(nèi),CdTe量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬而連續(xù),最大激發(fā)峰位于300 nm;而土霉素在275 nm和360 nm處強(qiáng)烈的吸收峰,且與CdTe量子點(diǎn)的激發(fā)光譜有較好地重疊,從而滿足二者發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)的條件。

    圖1 CdTe量子點(diǎn)的熒光激發(fā)光譜(a)和土霉素的紫外-可見吸收光譜(b)Fig.1 Fluorescence excition spectrum of CdTe QDs(a)and absorption spectrum of OTC(b)

    2.2 不同濃度土霉素對CdTe量子點(diǎn)熒光光譜的影響

    在激發(fā)波長330 nm條件下,分別掃描加入土霉素溶液前后CdTe量子點(diǎn)的熒光光譜,進(jìn)一步考察不同濃度土霉素對CdTe量子點(diǎn)熒光光譜的影響(如圖2所示)。由圖2可以看出,未加入土霉素時,CdTe量子點(diǎn)在520 nm處有最大熒光發(fā)射峰;隨著土霉素濃度的增加,CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明土霉素和CdTe量子點(diǎn)之間發(fā)生有效的內(nèi)濾效應(yīng),即土霉素吸收CdTe量子點(diǎn)發(fā)射的激發(fā)光能量,而導(dǎo)致CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度顯著降低。因此可以利用土霉素調(diào)控CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,從而建立一種熒光測定土霉素含量的新方法。

    圖2 不同濃度土霉素存在下CdTe量子點(diǎn)的熒光光譜Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe

    2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

    2.3.1 pH值的影響

    在不同pH值Tris-HCl緩沖溶液條件下,分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,考察Tris-HCl緩沖溶液pH值對體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響(如圖3所示)。由圖3可以看出,在強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的Tris-HCl緩沖溶液中,土霉素對CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度具有一般性猝滅,而當(dāng)pH值為6.5時,體系熒光猝滅值ΔF達(dá)到最大。因此試驗(yàn)選擇Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.5。

    圖3 pH值對體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

    2.3.2 CdTe量子點(diǎn)濃度的影響

    在5 mL比色管中,分別加入一定量的土霉素溶液和不同濃度的CdTe量子點(diǎn)溶液,作用一段時間后分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,考察CdTe量子點(diǎn)濃度對體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響(如圖4所示)。由圖4可以看出,隨著CdTe量子點(diǎn)濃度的增加,體系熒光猝滅值ΔF逐漸增大,當(dāng)CdTe量子點(diǎn)濃度為5.0×10-6mol/L時ΔF達(dá)到最大值,但繼續(xù)增加CdTe量子點(diǎn)濃度,ΔF反而逐漸降低。選擇CdTe量子點(diǎn)濃度為5.0×10-6mol/L。

    圖4 CdTe量子點(diǎn)濃度對體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

    2.3.3 反應(yīng)時間的影響

    在5 mL比色管中,分別加土霉素溶液和CdTe量子點(diǎn)溶液,作用一段時間后分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,考察反應(yīng)時間對體系熒光猝滅強(qiáng)度的影響(如圖5所示)。由圖5可以看出,土霉素溶液加入CdTe量子點(diǎn)溶液5 min后,體系熒光猝滅值ΔF達(dá)到最大,且在隨后25 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。因此選擇反應(yīng)時間為5 min。

    圖5 反應(yīng)時間對熒光猝滅強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

    2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,在5 mL比色管中加入一定量的CdTe量子點(diǎn)溶液和Tris-HCl緩沖溶液,同時加入不同濃度的土霉素溶液,反應(yīng)5 min后測定體系的熒光強(qiáng)度,以體系熒光猝滅值(ΔF)對土霉素濃度(c)作圖(如圖6所示)。由圖6可以看出,隨著土霉素濃度的增加,體系熒光猝滅值ΔF逐漸增大,且與土霉素濃度在2.0~20.0 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為ΔF=6.082 73c-0.5,相關(guān)系數(shù)r為0.999 5,檢出限為0.05 μg/mL(按3SD/斜率計(jì)算,其中SD為11份空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。同時對10.0 μg/mL的土霉素溶液進(jìn)行11次平行測定,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%。

    圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve

    2.5 干擾性實(shí)驗(yàn)

    當(dāng)土霉素濃度為10.0 μg/mL時,考察牛奶中常見物質(zhì)對土霉素含量測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)相對誤差在 ±5.0% 內(nèi),500 倍的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cl-、NO3-、SO42-、PO43-和100倍的乳糖、蔗糖,對土霉素含量測定基本無影響,表明該方法具有較好的選擇性,可用于牛奶中土霉素含量的測定。

    2.6 樣品中土霉素含量測定及回收率實(shí)驗(yàn)

    準(zhǔn)確量取1.0 mL牛奶樣品置于50 mL離心管中,加入10 mL乙酸鹽緩沖液-乙腈混合溶液(體積比1∶4),振蕩搖勻5 min,5 000 r/min 離心 20 min 除去蛋白質(zhì)。取上清液至分液漏斗中,加入5 mL正己烷,振蕩搖勻5 min,靜置分層后棄去正己烷層。吸取下層清液,用正已烷反復(fù)脫脂至澄清,溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后得待測液。

    準(zhǔn)確吸取一定體積的樣品待測液,按照實(shí)驗(yàn)方法測定其熒光強(qiáng)度,未檢出土霉素。為考察方法的可行性,同時進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表1可以看出,加標(biāo)回收率在97.4% ~103.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.4%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

    表1 土霉素在牛奶樣品中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of OTC in milk samples(n=6)

    3 結(jié)論

    從水熱合成巰基乙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)中發(fā)現(xiàn),土霉素吸收光譜和CdTe量子點(diǎn)的熒光激發(fā)光譜有較好地重疊,基于土霉素和CdTe量子點(diǎn)間的內(nèi)濾效應(yīng),建立一種測定土霉素含量的熒光分析法。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,CdTe量子點(diǎn)的熒光猝滅值與土霉素濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r為0.999 5,檢出限為0.05 μg/mL。該方法操作簡便、穩(wěn)定性好,能夠用于牛奶中土霉素含量的測定。

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