聯(lián)合常規(guī)核型分析和FISH在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的應(yīng)用價(jià)值

陳萬(wàn)紫，黃慧芳，陳加弟，林曉嵐，傅 薔(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院福建省血液病研究所，福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001;通訊作者，E-mail:huanghuif@126．com)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是最常見(jiàn)的兒童白血病類型。細(xì)胞遺傳學(xué)特征是目前公認(rèn)的具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的指標(biāo)［1］，在形態(tài)學(xué)檢查與免疫表型分析的基礎(chǔ)上，檢測(cè)患者遺傳學(xué)異常對(duì)于指導(dǎo)兒童ALL危險(xiǎn)度分層、判斷預(yù)后及“量身定制”治療方案具有重要作用。本研究采用間期熒光原位雜交((fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)，6組特異性 DNA探針檢測(cè)189例兒童ALL骨髓標(biāo)本的遺傳學(xué)異常，并與常規(guī)染色體核型分析結(jié)果相比較，旨在探討核型分析聯(lián)合FISH技術(shù)檢測(cè)兒童ALL遺傳學(xué)異常的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1．1 病例

189例ALL患兒2013－01～2014－12在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科就診住院，符合ALL的WHO標(biāo)準(zhǔn)［2］。其中男105例，女84例;年齡16－156個(gè)月，中位年齡為63個(gè)月。

1．2 R顯帶技術(shù)核型分析

采用直接法和短期培養(yǎng)法制備骨髓染色體標(biāo)本，并采用常規(guī)R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體核型依《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2013)》的規(guī)定進(jìn)行描述。剩余細(xì)胞懸液保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．3 組合FISH檢測(cè)

1．3．1 標(biāo)記探針 探針選擇 TEL/AML1，BCR/ABL，MLL，CSF4，CSP10 與 CSP17(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。

1．3．2 FISH檢測(cè) 將骨髓細(xì)胞懸液滴片，嚴(yán)格按照探針試劑盒提供的FISH操作說(shuō)明書(shū)操作。

1．3．3 熒光顯微鏡檢測(cè)及結(jié)果判斷 用Olympus BX51熒光顯微鏡，油鏡下通過(guò) DAPI、FITC與RHOD濾光片計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光雜交信號(hào)，不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞。

1．4 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 常規(guī)染色體R顯帶核型分析結(jié)果

189例患兒骨髓標(biāo)本中培養(yǎng)成功的有151例(79．89%)，檢出異常核型 58 例(38．41%)，其中僅染色體結(jié)構(gòu)異常者23例，僅數(shù)目異常的18例，同時(shí)合并染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常17例。染色體結(jié)構(gòu)異常涉及的染色體依次為9號(hào)(18/40)，14號(hào)(9/40)，6號(hào)(8/40)，8 號(hào)(7/40)，22 號(hào)(7/40)，19號(hào)(6/40)等。

本研究共檢出高超二倍體(染色體數(shù)目＞50)19例(12．58%)，低超二倍體(染色體數(shù)目47－50)7 例(4．64%)，假二倍體 3 例(1．99%)，亞二倍體 7例(4．64%)。常見(jiàn)增多的染色體按檢出率從大到小依次為 21號(hào)，10號(hào)，4號(hào)，17號(hào)，18，14號(hào)，8號(hào)，6號(hào)，22號(hào)，11號(hào)，12號(hào)及X染色體等。本研究檢測(cè)到的染色體易位見(jiàn)表1。

表1 ALL兒童檢測(cè)到的染色體易位分布Table 1 Incidence of various types of chromosome translocation in 189 children with ALL

2．2 FISH檢測(cè)結(jié)果

189例標(biāo)本均進(jìn)行組合FISH檢測(cè)，129例檢測(cè)出異常(68．25%)，60 例未檢出異常(31．75%)。在檢出的異常中常見(jiàn)的有+17(92/129，71．13%)，+10(90/129，69．77%)，+4(56/129，43．14%)，AML1信號(hào)擴(kuò)增(57/129，44．19%)，BCR 信號(hào)擴(kuò)增(30/129，23．26%)，TEL/AML1 融合(39/129，30．23%)，MLL 斷裂(21/129，16．28%)，ABL 信號(hào)擴(kuò)增(17/129，13．18%)，TEL 信號(hào)擴(kuò)增(18/129，13．95%)，BCR/ABL融合(10/129，7．75%)。38例骨髓標(biāo)本未培養(yǎng)成功的患者中FISH檢出異常的有23例(60．52%)，93例正常核型經(jīng)FISH檢測(cè)出異常的有67 例(72．04%)。

本研究中，39例(39/189，20．63%)FISH 檢出TEL/AML1融合基因，10 例(10/189，5．29%)檢出BCR/ABL融合基因，TEL/AML1檢出率明顯高于BCR/ABL(χ2=18．38，P ＜0．05)。

2．3 常規(guī)核型分析與FISH檢測(cè)的方法學(xué)比較

表2結(jié)果顯示，189例標(biāo)本中有148例檢出遺傳學(xué)異常，單獨(dú)FISH檢出129例，而染色體核型分析僅檢出58例?？梢?jiàn)，F(xiàn)ISH檢測(cè)兒童ALL遺傳學(xué)異常陽(yáng)性率明顯高于常規(guī)染色體核型分析(χ2=46．25，P ＜0．005)。

染色體核型正常的標(biāo)本通過(guò)FISH檢測(cè)出異常的67例(67/93，72．04%)，在染色體制備失敗的38例標(biāo)本中 FISH檢出異常的有23例(23/38，60．53%)，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0．18，P ＞0．05)。

本研究中，有 19例(19/189，10．05%)標(biāo)本FISH未檢出異常，但通過(guò)常規(guī)核型分析檢出了染色體數(shù)目和/或結(jié)構(gòu)異常。

表2 染色體核型分析與FISH檢出遺傳學(xué)異常的比較 (例)Table 2 Comparison of chromosomal abnormalities detected by CCA and FISH (cases)

3 討論

常規(guī)核型分析主要檢測(cè)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，對(duì)白血病的預(yù)后判斷與指導(dǎo)臨床治療至關(guān)重要。細(xì)胞遺傳學(xué)特征是目前公認(rèn)的具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的指標(biāo)［1］，但遺傳學(xué)異常的檢出率有較多的影響因素，本組資料顯示聯(lián)合常規(guī)核型分析和組合FISH檢測(cè)可將兒童ALL的遺傳學(xué)異常檢出率提高至78．31%，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［3］。在常規(guī)核型分析方面，兒童 ALL染色體制備成功率不高，本研究為79．89%，略高于劉青等的報(bào)道［4］，但異常檢出率(38．41%)低于文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］。本研究中 151 例骨髓培養(yǎng)成功的標(biāo)本中高超二倍體占12．58%，低超二倍體占4．64%，亞二倍體占 4．64%，假二倍體占1．99%，與郭嘩等［6］的報(bào)道相近。Sutcliffe 等［7］研究表明4、10或17號(hào)染色體三體提示預(yù)后較好，在本研究有129例標(biāo)本FISH檢測(cè)出不同程度的遺傳學(xué)異常(68．25%)，且主要數(shù)目異常為 +17，+10，+4等。本組FISH檢測(cè)出主要的融合基因?yàn)門(mén)EL/AML1(20．63%)，這與 Rubnitz 等［8］的研究相近。1994年Romana等［9］用FISH方法發(fā)現(xiàn)兒童ALL的隱匿性重現(xiàn)型易位t(12;21)。該易位產(chǎn)生的融合基因 TEL/AML1被證實(shí)是其發(fā)病的關(guān)鍵［10］，但t(12;21)用染色體核型分析檢出率不足0．05%［11］。本研究R顯帶分析未能檢出t(12;21)，這與其只能分析大于1條帶即相對(duì)分子量＞104×103的異常，而且無(wú)法檢出亞顯微水平的染色缺失或重排有關(guān)［12］。兒童 ALL常見(jiàn)另一個(gè)融合基因是 BCR/ABL，研究表明Ph染色體對(duì)兒童ALL具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值［13］，在本組研究中，確定的有Ph染色體的患兒10 例(5．29%)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［14］。

FISH技術(shù)能對(duì)間期和中期細(xì)胞進(jìn)行分析，擴(kuò)大了可檢測(cè)的細(xì)胞群體，其采用原位雜交技術(shù)，定位至小片段基因，能分辨較小的染色體易位或缺失區(qū)域(相對(duì)分子質(zhì)量50×103左右)等［15］，這在一定程度上彌補(bǔ)了核型分析的不足，提高了異常檢出率。在本研究中染色體核型正?；蛉旧w制備失敗的141例標(biāo)本中通過(guò)FISH檢測(cè)出異常的有90例。顯然，與核型分析相比，采用組合探針的FISH檢測(cè)更為敏感。但是，在60例FISH未檢出異常的標(biāo)本中，有19例通過(guò)核型分析檢測(cè)到染色體數(shù)目和/或結(jié)構(gòu)異常;另外，在FISH和核型分析均檢出一定程度遺傳學(xué)異常的39例標(biāo)本中，有31例的核型分析能在FISH檢出染色體異常的基礎(chǔ)上，檢出了其他的染色體數(shù)目和/或結(jié)構(gòu)異常。因此，R顯帶分析能更全面、詳細(xì)地了解白血病細(xì)胞的遺傳學(xué)信息，仍是白血病遺傳學(xué)的研究基礎(chǔ)。本研究189例兒童ALL患者通過(guò)R顯帶分析和FISH共檢出細(xì)胞遺傳學(xué)異常者148例(78．31%)，均顯著高于單用FISH檢測(cè)或單用核型分析的檢出率;由此可見(jiàn)，組合FISH技術(shù)與R顯帶技術(shù)能顯著提高兒童ALL染色體異常的檢出率。

總之，常規(guī)染色體核型分析仍是檢測(cè)兒童ALL的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常必不可少的手段，F(xiàn)ISH則是其重要的補(bǔ)充，二者聯(lián)合應(yīng)用，可提高兒童ALL染色體異常檢出率，獲得更多、更精細(xì)、全面的兒童ALL的遺傳學(xué)信息，提高遺傳學(xué)檢測(cè)在兒童ALL的預(yù)后評(píng)估以及追蹤白血病微小殘留等方面的作用。

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