siRNA沉默Smad4對(duì)奧沙利鉑抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移的影響

馬琳艷，宋樂(lè)樂(lè)，黃瑩瑩，孫小錦，董淑英，蔣志文，劉 浩(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，蚌埠 33030;蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科;通訊作者，E-mail:liuhao6886@foxmail．com)

乳腺癌是女性最常發(fā)的惡性腫瘤之一，盡管近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)對(duì)于乳腺癌的研究取得了重要的進(jìn)展，術(shù)后無(wú)病生存率和總體生存率明顯升高，每年仍約有30%的患者死于乳腺癌的復(fù)發(fā)和遷移［1］。研究表明在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段都有miRNAs的參與，扮演著致癌或抑癌基因，故探索乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)miRNAs成為近年來(lái)治療和預(yù)防乳腺癌遷移性復(fù)發(fā)的研究熱點(diǎn)之一［2］。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默Smad4能減弱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)的 MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力，可能與其抑制機(jī)制金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表達(dá)有關(guān)［3］。近年來(lái)有大量關(guān)于Smad4基因失活和腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究，然而關(guān)于評(píng)估Smad4表達(dá)和乳腺癌侵襲和遷移間關(guān)系的研究目前卻很少。因此本研究以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察 siRNA Smad4轉(zhuǎn)染后奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移活性的變化，并探討其可能機(jī)制，以期為siRNA用于乳腺癌侵襲遷移的防治提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1．1．2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、MTT購(gòu)于美國(guó) GIBCO公司;OXA，批號(hào):H20093167，齊魯制藥有限公司;Transwell小室:美國(guó)Corning公司;Smad4 siRNA序列:AAC TAC AAA TGG AGC TCA TCC，德國(guó)Qiagen公司設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)染試劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;兔抗人Smad4、TGF-β、MMP-9 抗體:武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG:中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TGF-β、MMP-9 ELISA試劑盒:美國(guó)R＆D公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液，含10%滅活FCS，2．0 g/L碳酸氫鈉，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 為觀察 OXA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用，實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度 OXA(0．25，0．5，1，2，4 μmol/L)處理MDA-MB-231細(xì)胞，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔100 μl培養(yǎng)液含7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后，棄去每孔培養(yǎng)液，用含不同濃度 OXA(0．25，0．5，1，2，4 μmol/L)處理，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h后每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液10 μl繼續(xù)孵育4 h，棄上清;每孔加 DMSO 150 μl，37 ℃孵育 30 min，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的570 nm波長(zhǎng)吸光度A值，各藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)3組。

1．2．3 siRNA轉(zhuǎn)染 探索最佳的轉(zhuǎn)染效率:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗1遍，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將不同體積脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000，Life Technologies)與 50 μl opti-MEM 混勻，1 μl陰性對(duì)照6－羧基熒光素(negative control FAM，NC-FAM)(5'－ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3')與 50 μl opti-MEM混勻，靜置5 min，將Lipofectamine 2000加入到NC-FAM中，按照Lipofectamine 2000∶NC-FAM=1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，5∶2 的比例結(jié)合成復(fù)合物，靜置20 min，將復(fù)合物加入到每孔中，并加入opti-MEM使每孔終體積為2 ml。12 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并選取1∶1為最佳比例。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后按1∶1的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換新鮮培養(yǎng)液，次日收集細(xì)胞提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)Smad4 siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)的影響。

1．2．4 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，用對(duì)照組、1 μmol/L OXA 組、Smad4 siRNA 組、1 μmol/L OXA+Smad4 siRNA 組含1%血清的培養(yǎng)基重懸，每個(gè)Transwell小室的上室加入5×104細(xì)胞，下室加入 600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，加入時(shí)避免氣泡的產(chǎn)生。置于5%CO2，37℃，飽和濕度環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上室中培養(yǎng)液，PBS漂洗2－3次，常溫下置于4%多聚甲醛固定15 min。用棉簽吸去上室內(nèi)液體，1%結(jié)晶紫染液室溫下染色15 min，PBS漂洗2－3次，顯微鏡下每孔隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目并取平均值。每組細(xì)胞均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將預(yù)冷的Matrigel膠與無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋鋪于Transwell小室上下室之間，每孔50 μl均勻包被于Transwell小室底部膜內(nèi)，置培養(yǎng)箱30 min使之成膠。其余步驟均與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1．2．6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中并混合均勻。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用200 μl的無(wú)菌槍頭每隔1 cm垂直于橫軸進(jìn)行劃痕，用PBS漂洗去除劃下的漂浮細(xì)胞，加入對(duì)照組、1 μmol/L OXA 組、Smad4 siRNA 組、1 μmol/L OXA+Smad4 siRNA組的無(wú)血清培養(yǎng)基。置于5%CO2，37℃，飽和濕度環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，于0，24 h觀察細(xì)胞的劃痕愈合情況并拍照。

1．2．7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞種入六孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h后設(shè)對(duì)照組、1 μmol/L OXA 組、Smad4 siRNA 組、1 μmol/L OXA+Smad4 siRNA組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集蛋白。將收集的細(xì)胞離心5 min，2 500 r/min，棄上清，每管加入150 μl的細(xì)胞裂解液并重懸打勻后遷移入1 ml的離心管中，冰上裂解30 min。裂解完畢后4℃離心15 min，12 000 r/min，取上清液并用BCA蛋白定量法測(cè)各組蛋白含量并用裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度并與2×上樣液以1∶1比例混合，于100℃煮沸3 min使蛋白變性。取20 μg每組，用 10%SDS-PAGE 凝膠電泳(70 V，30 min，90 V，90 min);轉(zhuǎn)膜(250 mA，150 min)至PDVF 膜;5%脫脂牛奶封閉 2 h;一抗(兔抗人 Smad4、TGF-β、MMP-9，抗體濃度1∶100)，封閉過(guò)夜;TPBS洗3次，PBS洗1 次，15 min/次;山羊抗兔二抗 1∶1 000，室溫孵育2 h;TPBS洗3次，每次15 min;Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1．2．8 ELISA檢測(cè)MMP-9和TGF-β 活性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞按每孔5×104個(gè)細(xì)胞種入十二孔板中，設(shè)對(duì)照組、1 μmol/L OXA組、Smad4 siRNA 組、1 μmol/L OXA+Smad4 siRNA 組，24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用BCA試劑盒檢測(cè)其蛋白含量并用培養(yǎng)液稀釋至等蛋白含量。裝入1．5 ml的離心管中，4℃離心15 min，16 000 r/min。加入實(shí)驗(yàn)前將試劑盒取出室溫平衡20 min。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，在標(biāo)準(zhǔn)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品(S0－S5)各50 μl;樣品孔加樣品10 μl和樣品稀釋液40 μl。除空白孔外每孔加入檢測(cè)抗體100 μl，用封版膜封住，于37℃恒溫箱培育60 min。培育完畢后，棄去孔內(nèi)液體并用洗滌液洗5次。每孔加入底物A、B各50 μl，于37℃孵育15 min。每孔加入50 μl終止液并于15 min內(nèi)檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度(A)值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 OXA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制作用

MTT結(jié)果表明，隨著OXA濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率下降。1 μmol/L的OXA作用于MDA-MB-231細(xì)胞后24，48，72 h，細(xì)胞存活率分別是(77．42 ±3．98)%、(60．38 ±3．65)% 和(40．15 ±4．37)%(見(jiàn)圖1)。

2．2 siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞中Smad4表達(dá)下降

圖1 OXA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后24，48，72 h細(xì)胞存活率變化Figure 1 Changes of the viability of MDA-MB-231 cells after treatment with OXA for 24，48 and 72 h

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Smad4 siRNA組Smad4蛋白表達(dá)明顯降低(見(jiàn)圖2A)。測(cè)定灰度值并計(jì)算出Smad4 siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)抑制率為(60．44±3．95)%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)圖2B)。

圖2 Smad4 siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中Smad4蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of Smad4 siRNA on the expression of Smad4 protein in MDA-MB-231 cells

2．3 Smad4 siRNA對(duì)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、1 μmol/L OXA 組、Smad4 siRNA 組、1 μmol/L OXA+Smad4 siRNA 組，以觀察Smad4 siRNA對(duì)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響。

2．3．1 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3A，3B)，與對(duì)照組相比，OXA組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲抑制率分別為(35．16 ±1．15)% 和(39．59 ±2．43)%，Smad4 siRNA組分別為(43．89 ±3．04)% 和(34．69 ±3．12)%，OXA+Smad4 siRNA 組為(61．85 ±4．54)%和(65．31±3．07)%。提示 Smad4 siRNA 可以增強(qiáng)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲活性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖3 Transwell小室法檢測(cè)OXA和Smad4 siRNA及兩者合用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化Figure 3 Effects of OXA，Smad4 siRNA and their combination on MDA-MB-231 cell invasion and migration assessed by Transwell small chamber assay．

2．3．2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:OXA組和Smad4 siRNA組均可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合速度，而OXA+Smad4 siRNA組更明顯抑制了劃痕的愈合(見(jiàn)圖4)。提示Smad4 siRNA可以增強(qiáng)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移的活性。

2．4 Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染增強(qiáng)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞中TGF-β和MMP-9蛋白表達(dá)和活性的作用

Western blot(見(jiàn)圖5A)及ELISA(見(jiàn)圖5B)結(jié)果均顯示，單獨(dú)使用OXA組和Smad4 siRNA組均可抑制TGF-β和MMP-9蛋白和活性表達(dá)，合用后抑制作用增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

3 討論

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OXA和Smad4 siRNA單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effects of OXA，Smad4 siRNA and their combination on MDA-MB-231 cell migration assessed by wound healing assay

圖5 OXA和Smad4 siRNA及兩者合用對(duì)TGF-β和MMP-9蛋白表達(dá)和活性的影響Figure 5 Effects of OXA，Smad4 siRNA and their combination on protein expressions and activities of TGF-β and MMP-9

在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，TGF-β發(fā)揮著抑癌基因及癌基因的雙重角色［4］。在細(xì)胞癌化早期促進(jìn)分化或凋亡，而在腫瘤發(fā)展期則喪失了這種應(yīng)答的敏感性，刺激血管生成、抑制免疫應(yīng)答、為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了良好的局部環(huán)境［5］。Wang等［6］發(fā)現(xiàn)，下調(diào) TGF-β 的表達(dá)可以通過(guò)調(diào)控ERK/S100A4通路抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移活性。TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子是胞質(zhì)蛋白Smads，經(jīng)典TGF-β通路中，TGF-β需與TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，而受體Ⅰ的轉(zhuǎn)磷酸化作用將Smad2/3磷酸化后再與Smad4結(jié)合形成三聚體移至細(xì)胞核，抑制上皮因子，促進(jìn)間質(zhì)蛋白表達(dá)［7］。Smad4在信號(hào)傳輸途徑中是唯一的共同介導(dǎo)型Smad，在TGF-β信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)移行傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8］。TGF-β/Smad傳導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移活性的相關(guān)性研究也提示了可以通過(guò)調(diào)控下調(diào)Smad4的表達(dá)從而使該通路的傳導(dǎo)受阻，減少TGF-β 信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)移行傳遞的過(guò)程［9，10］。

MMPs在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中至關(guān)重要，直接或間接引起MMPs蛋白水平降低、活性下降或基因沉默從而降低腫瘤細(xì)胞侵襲遷移活性成為研究熱點(diǎn)［11］。OXA是繼順鉑和卡鉑后的第三代鉑類化合物，可誘發(fā)DNA的一級(jí)和次級(jí)損傷，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，Smad4 siRNA能減弱TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲能力，可能與其抑制MMP-9的表達(dá)有密切關(guān)系［12］。劉保蘭等［13］發(fā)現(xiàn)，OXA 可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的侵襲和遷移且檢測(cè)到OXA作用后細(xì)胞中MMP-9的活性明顯受到抑制。Wiercinska等［14］證實(shí)了 Smad4 是 TGF-β 通過(guò) MMP-2和MMP-9表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲活性的重要因素。

siRNA沉默基因表達(dá)結(jié)合其他經(jīng)典藥物或經(jīng)典途徑用于腫瘤研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［15］，為實(shí)現(xiàn)多途徑、多通路綜合治療取得更好療效有重要意義。本課題通過(guò)siRNA沉默Smad4基因，觀察對(duì)OXA抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移活性的影響和可能機(jī)制。Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Smad4 siRNA和OXA單用均可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移，合用后抑制作用明顯增強(qiáng)。為了探索Smad4 siRNA增強(qiáng)OXA抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移活性的可能機(jī)制，Western blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示Smad4 siRNA和OXA單用均可使細(xì)胞中TGF-β和MMP-9蛋白和活性表達(dá)減少，且合用后更明顯減少。以上結(jié)果顯示，下調(diào)TGF-β和MMP-9蛋白和活性表達(dá)可能是降低乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移活性的有效途徑之一，且siRNA介導(dǎo)的Smad4沉默可增強(qiáng)OXA下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中TGF-β和MMP-9蛋白和活性表達(dá)的作用，從而使細(xì)胞的侵襲和遷移活性受到明顯抑制。

以上研究結(jié)果提示Smad4 siRNA可以增強(qiáng)OXA抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移的活性，其作用可能與干擾了TGF-β/Smad傳導(dǎo)通路和抑制MMP-9蛋白活性表達(dá)相關(guān)。本研究為siRNA用于治療乳腺癌提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

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